Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das interações hospedeiro-patógeno, como quais são as características únicas das células produtivamente infectadas, quais cofatores de hospedeiro permitem que os vírus estabeleçam infecção produtiva e como direcionar essas células em intervenções terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece medidas quantitativas tanto para proteínas quanto para mRNA dentro de células únicas, e a maioria dos reagentes estão disponíveis comercialmente. Demonstrando o procedimento de triagem celular estará Matthew Creegan, um técnico sênior do núcleo de citometria de fluxo no laboratório do Doutor Michael Eller.
Para começar, em uma estação de trabalho de biologia molecular pré-PCR designada, prepare a mistura de ensaios combinando 96 ensaios de expressão genética em um tubo RNase, livre de DNase certificando-se de adicionar cada ensaio a uma concentração final de 180 nanomolar de primers dianteiros e invertidos. Adicione o tampão de suspensão de DNA para obter a diluição apropriada da mistura de ensaio. Para cada matriz de chip 96 por 96, pipeta seis microliters de cada ensaio em um poço designado de uma placa PCR de 96 poços, em seguida, selar a placa com um adesivo.
Para começar a coloração superficial de células viáveis, em um armário de biossegurança da cultura tecidual, primeiro prepare as amostras de compensação e uma mistura mestre de coquetel de anticorpos fluorescentes, conforme descrito no protocolo de texto. Descongele as células criopreservadas em um banho de água de 37 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, adicione entre 5 e dois mililitros da suspensão celular a um tubo de 15 mililitros contendo 12 mililitros de PBS.
Centrifugar a 500 G por três minutos a 25 graus Celsius, depois aspirar o PBS e resuspensar a pelota em três mililitros de PBS fresco. Transfira esta mistura para um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Centrífuga mais uma vez a 500 G por três minutos a 25 graus Celsius.
Aspire o supernascer, deixando aproximadamente 10 microliters resíduos pbs. Em seguida, resuspende até 20 milhões de células lavadas em 80 microliters de coquetel de anticorpos. Incubar por 20 minutos a 25 graus Celsius enquanto estiver protegido contra a luz.
Depois disso, adicione três mililitros de PBS. Centrifugar a 500 G por três minutos e aspirar o supernante. Resuspense completamente as células em 300 a 500 microliters de PBS.
Filtre esta solução pipetando-a através de uma tampa de 35 micrômetros de célula de nylon. em seguida, manter as células no gelo e protegido da luz até o tipo. De volta à estação de trabalho pré-PCR, primeiro prepare a mistura de reação pré-AMP RT em um único tubo estéril livre de RNase, como descrito no protocolo de texto.
Usando uma pipeta multicanal, dispense 10 microliters desta mistura de reação no número desejado de 96 placas de coleta de tipo PCR bem. Sele a placa com filme adesivo e, em seguida, coloque a placa em um bloco de alumínio pré-refrigerado 96 bem. Depois disso, estabeleça o esquema de gating de classificação celular e prepare o classificador de células citométricas de fluxo conforme descrito no protocolo de texto.
Digite as configurações de instrumentos apropriadas para especificar o número e o subconjunto das células a serem classificadas em cada poço. Remova o selo adesivo e, em seguida, FACS classifique as células nas placas de coleta PCR preparadas 96 bem. Reseal a placa com filme adesivo fresco.
Imediatamente vórtice a placa resealada e, em seguida, centrífuga a 2000 G por um minuto a quatro graus Celsius. Termociclo a placa em uma máquina PCR com uma tampa pré-aquecido a 50 graus Celsius por 15 minutos seguido de 95 graus Celsius por dois minutos. Finalmente, termociclo para 18 ciclos de 95 graus Celsius por 15 segundos e 60 graus Celsius por quatro minutos, depois em uma estação de trabalho pós-PCR, transfira cinco microliters de cDNA em 20 microliters de tampão de suspensão de DNA em uma nova placa PCR de 96 poços.
Para começar, prepare a placa de ensaio qPCR, tubondo quatro microliters de reagente de carga de ensaios em cada poço. Em seguida, transfira quatro microliters de cada ensaio da placa de ensaio 2X para a placa qPCR. Mantenha a placa de ensaio qPCR a quatro graus Celsius.
Distribua os fluidos da linha de controle das seringas de escorvamento nas duas válvulas de admissão do chip. Remova o plástico protetor debaixo da placa. Coloque o chip em um controlador IFC com o lado entalhado na posição A1 e selecione e execute o script principal.
Para cada chip microfluido, misture 50 microliters do reagente de carregamento de amostras com 500 microliters de mix mestre pcr para preparar a mistura de reação em tempo real. Pipetas 4.4 microliters desta mistura de reação em cada poço de uma nova placa PCR de 96 poços agora designada como a placa de amostra. Em seguida, pipeta 3,6 microliters do CDNA previamente diluído em cada poço da placa de amostra.
Depois disso, transfira cinco microliters da placa de ensaio para o poço correspondente no lado entalhado do chip. Transfira cinco microliters da placa de amostra para o poço correspondente do outro lado do chip. Insira o chip carregado no controlador IFC e execute o script de mixagem de carga.
Em seguida, transfira o chip para a plataforma BioMark e configure o instrumento conforme descrito no protocolo de texto e, em seguida, salve o arquivo de execução do chip em uma pasta designada. Quando a execução do chip estiver concluída, abra o software de análise pcr em tempo real e selecione o arquivo, aberto, para abrir o chiprun. arquivo bml.
No canto superior esquerdo da janela de software, localize o explorador de chips e o resumo da execução do chip. Em resumo de execução do chip, clique na configuração do detector. Em tarefa, clique em novo e selecione a placa SBS tipo contêiner e o formato de contêiner SBS 96.
Clique no botão com a elipse ao lado do mapeamento e selecione M96-Assay-SBS96.dsp. Clique nas visualizações de análise. Na guia qPCR em tarefa, selecione a correção da linha de base para o método de derivativo linear e limiar de TC para detectores de usuários.
Na guia limiares ct, verifique o inicialize com caixa automática e, em seguida, clique no botão analisar. No quadrante superior direito das visualizações de análise, clique na segunda guia, tabela de resultados. No menu suspenso, selecione a exibição do mapa de calor e o mapa de calor com os dados aparecerá.
Sob o mapa de calor, clique no limiar e no gráfico de registro. Ajuste os limiares de tomografia manualmente para cada detector clicando em ensaios, representados por colunas no mapa de calor, e arrastando o limiar conforme necessário para cruzar as curvas de amplificação na fase exponencial. Quando terminar, clique em analisar.
Em seguida, exporte os dados qPCR como um arquivo csv. Transfira dados qPCR do computador BioMark para sua área de trabalho. Importe os dados em um software de planilha ou análise estatística e mapeie os resultados por amostra e posições de ensaio no chip.
Crie uma nova coluna e use uma fórmula condicional para organizar as células em grupos baseados na expressão de genes virais. Em análise, selecione fit Y por X e plote expressão genética versus grupo. Depois disso, use a versão 9 do FlowJo para abrir arquivos FCS do tipo FACS correspondente a uma placa de 96 poços.
Com o nome do arquivo destacado, selecione a plataforma, o portão do número do evento e crie portões de classificação indexados. Células individuais aparecerão exibidas por linha. Destaque todas as 96 células e selecione espaço de trabalho, exporte, selecione todos os andares compensados.
Em dados, selecione arquivo FCS, clique em exportar e selecione uma pasta designada. Arraste os novos arquivos FCS para células individuais em um novo espaço de trabalho FlowJo. Destaque todas as células e clique em adicionar estatísticas, representadas pelo botão sigma, média e todos os parâmetros de fluorescência.
Abra o editor da mesa, em seguida, destaque todos os andares do primeiro celular e arraste-os para a janela do editor da mesa. Nesta janela, clique em criar e visualizar a tabela. Depois disso, copie e exaboia em um software estatístico, copiando ou clicando no botão salvar e iniciar o aplicativo.
Mescle os dados FACS de célula única com os dados qPCR em JMP pelo número da placa e posição do poço. Por fim, realize análises gráficas e estatísticas sobre os dados combinados. Neste estudo, a quantitação de proteína de superfície unicelular por citometria de fluxo de vários parâmetros é integrada com a expressão quantitativa de mRNA de célula única por RTqPCR altamente multiplexado.
Mostrado aqui é uma única célula expressão quantitativa do gene de facs classificada células T de Rhesus macaque. Tat/rev positivo N de células negativas expressam menos cópias de tat/rev RNA do que o N de células positivas em verde escuro que é consistente com um estágio inicial de infecção antes da estabilização e uma exportação nuclear de RNA viral parcialmente emendado. Uma alta abundância de Gag-RNA não-pliced em tat/rev positivo N de células positivas é consistente com a infecção produtiva em estágio tardio durante a qual o RNA genômico abundante é expresso e embalado em virions brotantes.
Este enredo trivariado exibindo o gene viral de célula única, gene hospedeiro e expressão de proteína de superfície hospedeira mostra que a expressão da proteína CD4 e CD3 da superfície é diminuída em células tat/rev positivas mostradas em verde, embora as transcrições de CD4 e CD3 sejam sustentadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois ou três dias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar avaliação prototranscricional de células únicas direcionadas para abordar questões relativas a genes e proteínas expressos diferencialmente em células infectadas viralmente.
