גנגליוסידים באים לידי ביטוי על כל משטחי תאי החוליות והם נפוצים במיוחד על תאי עצב. הם מווסתים איתות תאים וזיהוי תאים. פרוטוקול זה מציג בידוד וניתוח ganglioside.
הטכניקות נבחרו כדי למקסם את התפוקות ganglioside בקנה מידה גדול וקטן תוך ייעול הטיהור. אנו מתארים גם שיטות לביצוע מהיר יחסית של ניתוחי גנגליוסיד איכותיים ועתיקים למחצה. מחקר על שומנים, במיוחד שומנים קוטביים כמו gangliosides, דורש כלים וטכניקות שונות מאשר עבודה עם חלבונים או חומצות גרעין.
וידאו זה מכיר אותך כיצד לעבוד עם מולקולות אלה. מכיוון שממסים כגון כלורופורם וטטרהידרופורן ממיסים פלסטיק נפוץ, אנו משתמשים בבקבוקי זכוכית ובקבוקונים עם כובעים מצופים טפלון, פיפטות זכוכית, זכוכית, מיקרו-מזרקים מפלדת אל-חלד והומוגניזרים מזכוכית טפלון לאורך הליכים אלה. כישלון לעשות זאת גורם פולימרים פלסטיים במוצרים שיכולים להפריע ניתוחים.
כדי להתחיל, להוסיף 4.1 מיליליטר של מים לכל גרם של משקל רטוב רקמה, הומוגניזציה אותו עם 10 משיכות. מוסיפים 13 מיליליטר של מתנול לגרם של רקמה. מעבירים לטמפרטורת סביבה של 22 מעלות צלזיוס, ומערבבים.
מעבירים את הרקמה לצינור עבה מוקף זכוכית, עם מכסה בורג מצופה ברגים עם מכסה בורג מצופה PTFE, ומערבבים היטב. מוסיפים 6.5 מיליליטר של כלורופורם לגרם של רקמה, מכסים אותו ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 450 פעמים g במשך 15 דקות.
לאחר מכן העבר את supernatant ברור לצינור רענן, בורג כתרים, ולמדוד את עוצמת הקול כמו נפח תמצית התאושש. עבור חלוקה למחיצות, להוסיף 0.173 פעמים את נפח החילוץ התאושש של מים כדי supernatant ברור. אז תכסה את זה.
מערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 450 פעמים g במשך 15 דקות. העבר את השלב העליון, המכיל את gangliosides, לתוך צינור זכוכית טרי עם כובע בורג מצופה PTFE.
כדי לבצע כרומטוגרפיה של מחסנית דו-פאזית הפוכה, השתמש במזרק זכוכית של חמישה מיליליטר כדי לשטוף מחסנית חילוץ של שלב מוצק tC18 עם שלושה מיליליטרים של מתנול. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של כלורופורם-מתנול-מים ביחס של שניים עד 43 עד 55. טען את השלב העליון מהשלב הקודם על מחסנית tC18 באמצעות אותו מזרק זכוכית.
אסוף את הזרימה וטען אותה מחדש לעמודה כדי למטב את הספיחה. לשטוף את המחסנית עם שלושה מיליליטרים של כלורופורם-מתנול-מים ולאחר מכן עם שלושה מיליליטרים של מתנול-מים. לרומם את gangliosides עם שלושה מיליליטר של מתנול לתוך צינור טרי, בורג כתרים.
התאדו ליובש תחת זרם עדין של חנקן בטמפרטורה נמוכה או שווה ל -45 מעלות צלזיוס. מתמוססים במתנול במיליליטר אחד לגרם של משקל רטוב של רקמות מקוריות. מניחים 100 גרם של חומר אפור במוח בבלנדר, ומוסיפים מיליליטר אחד לגרם משקל רטוב במוח של חיץ אשלגן פוספט צונן, 10 מ"מ של pH 6.8.
ואז הומוגני על נמוך במשך 20 שניות. מוסיפים שמונה מיליליטר של טטרה-הידרופורן לגרם משקל רטוב במוח, והומוגניים על נמוך במשך 10 שניות. דקאנט לבקבוקי צנטריפוגות זכוכית, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g במשך 15 דקות.
לאסוף את supernatant, למדוד את נפחו, ולאחר מכן להעביר אותו למשפך הפרדת זכוכית. הוסף 0.3 מיליליטר של אתיל אתר למיליליטר של supernatant. לנער במרץ.
ואז לאפשר לו לשבת באין מפריע במשך 30 דקות, שבמהלכן שני שלבים, שלב אתר עליון שלב מימית נמוכה יותר, נפרדים. לאסוף את השלב התחתון, המכיל את gangliosides, לתוך בקבוק זכוכית עם כובע מצופה PTFE. לשלב האתר העליון שנותר במשפך המפריד, הוסף 0.1 מיליליטר של מים למיליליטר של סופר-נרטיב מקורי מהשלב הקודם.
לנער במרץ. אפשר לשלבים להיפרד. לאחר מכן לאסוף את השלב מימי התחתון, ולשלב אותו עם השלב התחתון שנאסף בעבר.
התאדו את השלבים התחתונים המשולבים לאבקה יבשה, ושקלו אותה. כדי לבצע כרומטוגרפיה של שלב הפוך, שטפו מראש מחסנית חילוץ tC18 מוצקה בקנה מידה גדול על ידי העברת 50 מיליליטר של ממסים דרך העמודה באמצעות ואקום או לחץ במשך פחות מדקה אחת לכל שטיפה. טען את השלב העליון מהפרדת השלב שלאחר הספוניפיקציה לעמודה באמצעות ואקום או לחץ.
לאחר מכן לאסוף את הזרימה דרך, לטעון אותו מחדש, ולאסוף את הזרימה דרך שוב לניתוח הבא. לשטוף את הטור עם 30 מיליליטר כל אחד של כלורופורם-מתנול-מים, ואחריו מתנול-מים. ואז לברוח gangliosides עם 50 מיליליטר של מתנול ולאחר מכן שוב עם 10 מיליליטר של מתנול.
לאסוף כל שטיפה ו elution בנפרד. השתמש כרומטוגרפיה שכבות דקות, או TLC, כדי לאשר כי gangliosides נעדרים מן הזרימה דרך ושוטף ו eluted בהתרוממות הראשונה של מתנול. התאדו את הגנגליוסידים המנוטרלים לאבקה יבשה, ושקלו אותם.
כדי לבצע TLC, לשפוך ממס פועל לתוך 10 על 10 ס"מ, תא TLC זכוכית עם כיסוי נירוסטה, כך עומק הממס הוא 0.5 ס"מ. לכסות את התא, ולאפשר לו שיווי משקל במשך כ 10 דקות. שטפו מזרק המילטון 10 מיקרוליטר עם מחט משופעת באמצעות מתנול.
צייר מיקרוליטר אחד של מתנול לתוך מזרק זכוכית כדי למלא את הנפח המת מחט ולאחר מכן מיקרוליטר אחד של מדגם או סטנדרטי. לזהות את המדגם באופן שווה על חמישה מילימטר, קווים מסומנים מראש עד פחות ממיקרוליטר אחד של ממס מתנול נשאר במזרק. אפשר לצלחת להתייבש ב 22 מעלות צלזיוס לאחר כל הדגימות הם הבחינו.
מניחים את הצלחת המנוקדת והמיובשת על תא TLC המשתווה מראש כאשר הקצה התחתון שקוע בממס הרץ. אפשר ממס פועל להתקדם במעלה הצלחת על ידי פעולה נימית עד חזית הממס מגיע בתוך סנטימטר אחד של החלק העליון של הצלחת. הסר וסמן את חזית הממס בקצה הצלחת עם עיפרון.
אפשר לממסים להתאדות לחלוטין או ללא הפרעה או תחת זרימת אוויר קלה. במכסה המנוע של האדים הכימיים, הניחו את צלחת ה-TLC עם מקור הגאנגליוזידים שנפתרו במהופך בקופסת קרטון חתוכה כדי להגן על קירות מכסה המנוע מפני תרסיס חומצה. מניחים ריאגנט תרסיס רססוריטול במרסס TLC זכוכית.
חבר אותו למקור של חנקן בלחץ, ומרסס קלות את הצלחת באלכסון בכיוונים האנכיים והאופקיים. מיד לכסות את הצלחת עם צלחת כיסוי זכוכית נקייה, יבשה, של אותם ממדים, ולאבטח את צלחת הכיסוי במקום עם קליפס קלסר. מחממים את הצלחת המכוסה ב 125 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
גנגליוסידים יופיעו סגול כהה על רקע לבן. כדי לבצע כתמי שומנים בדם, לטבול את צלחת TLC עם צד המקור gangliosides נפתר למטה לתוך המכילה את כתם anisaldehyde. שקועים לחזית הריצה לקצת יותר משתי שניות.
אז תן לו להתנקז. מחממים את צלחת TLC על צלחת חמה בטמפרטורה נמוכה כדי לפתח. פרוטוקול זה מספק gangliosides בכמות מספקת וטוהר לקביעה איכותית וכמותית.
רזולוציית TLC של מיקרוליטר אחד מספקת חומר רב לגילוי רסורצינול ופותרת את כל הגרעיניוזדים העיקריים במוח עבור עכברים מסוג בר מהונדסים גנטית. למרות gangliosides מעורב מוכן אינם חופשיים שומנים מרכזיים אחרים, הם של טוהר מספיק לקביעת ספקטרומטרי מסה או כמו gangliosides מטוהרים ילידים במצב שלילי או לאחר טרום מתילציה במצב חיובי. טיהור בקנה מידה גדול כולל מיצוי, סאפוניפיקציה ורזולוציית HPLC כדי לספק גנגליוסידים מרכזיים מטוהרים למוח המתאימים לניסויים ביולוגיים ולשינויים כימיים ואזימטיים נוספים.
פרופיל HPLC למופת וניתוח TLC עוקב מוצגים. טיפול אלקלי, או סאפוניפיקציה, יש צורך הידרוליזה ולהסיר פוספוליפידים מזהמים, אבל גם הידרוליזה שינויים טבעיים של gangliosides כגון חומצות סיאליות O-אצטילated, אשר עשוי להיות חשוב בהקשרים מסוימים. יחסי ממס מדויקים עבור מיצוי, חלוקה למחיצות ממסים ורזולוציית TLC הם קריטיים לשיפור ההתאוששות, הטוהר והניתוחים.
מסרטן לחילוף חומרים ועד לתפקוד המוח, גנגליוסידים הם מכפילים פיזיולוגיים ויעדים טיפוליים. בידוד גנגליוסייד, טיהור וניתוחים הם אבני יסוד לגילוי ביו-רפואי והתפתחות טיפולית.
