Bem-vindo ao Instituto de Biologia Celular e Patologia, Nicolae Simionescu de Bucareste, Romênia. Aqui no Laboratório de Transdução Viral, mostramos uma parte da produção de partículas adenovirais utilizando uma metodologia otimizada baseada no sistema AdEasy desenvolvido pelo Professor Vogelstein. Os principais passos da tecnologia para a produção deste adenovírus são, um, uma recombinação do pAdTrack contendo GFP com o plasmídeo pAdEasy-1 na bactéria BJ5183.
Dois, embalando as partículas adenovirais. Três, amplificação do adenovírus em células AD293. Quatro, purificação das partículas adenovirais do meio de lise celular e cultura.
Cinco, titulação viral e teste funcional do adenovírus. Aqui, apresentaremos um passo importante da metodologia. A purificação das partículas adenovirais do meio de lise celular e cultura.
A purificação do adenovírus começa com a colheita das células produtoras de vírus e do meio. As células AD293 foram transfectadas com o plasmídeo recombinante e como o adenovírus foi embalado. Em seguida, o adenovírus foi amplificado por sucessivas culturas maiores.
Aqui, obtivemos 25 placas T175, e iniciamos a purificação do adenovírus a partir do lisecelular e do meio cultural. Primeiro, verificamos a fluorescência verde do GFP expressa pelas células transduzidas. Se as células ainda estiverem presas, vamos desligá-las tocando no prato de cultura ou usando um raspador longo.
As células e o meio são coletados. Os frascos são lavados com PBS, que também é coletado em tubos Falcon. As células são pelotas por centrifugação.
Mantenha a pelota celular, bem como o meio para purificação do adenovírus. Nesta etapa, a ajuda de um colega é bem apreciada para acelerar o processo de colheita. A pelota da célula é verde devido à expressão GFP.
A pelota é resuspendida em tampão tris hipertônico, o que facilitaria a interrupção das células. Para a lise celular, usamos nitrogênio líquido e o gás seco aqueceu até 37 graus. Não realize mais de três ciclos, pois o vírus seria danificado.
Para aumentar a eficiência da interrupção celular passe cuidadosamente a célula homogeneizar através de uma agulha de seringa calibre 23. Centrifugar a célula lysate a 9,600 x g por 12 minutos. Passe o supernante em novos tubos e descarte as pelotas.
Mantenha o supernatante no gelo para processamento posterior por ultracentrifuagem. Agora, processamos o meio cultural para isolar o adenovírus liberado das células. Para isso, primeiro, ponderamos a quantidade necessária de sulfato de amônio e adicionamos à garrafa em que o meio de cultura foi coletado.
A garrafa é agitada vigorosamente até que os cristais sejam completamente dissolvidos. A mistura é incubada à temperatura ambiente por duas horas e a metade. Em seguida, a suspensão do precipitado é dividida em tubos Falcon.
Centrífuga por 15 minutos a 1.600 x g. Após a centrifugação, o supernasal é descartado e a pelota é resuspended em 10 milimôlars tris tampão. Se não se pode continuar a purificação do adenovírus com a etapa de ultracentrifugação, o precipitado pode ser mantido por alguns dias a quatro graus, mas somente após a diálise para remover o sulfato de amônio.
Aqui, apresentamos o passo da diálise. Usamos uma seringa para introduzir a suspensão em um previamente molhado. As amostras são dialisados contra 10 milimões de tampão Tris durante a noite a quatro graus.
A etapa final da purificação é representada pelo passo de ultracentrifugação em um gradiente de cloreto de césio. Para formar o gradiente, primeiro, pipetamos três mililitros da solução de alta densidade do cloreto de césio. Em cima desta camada, despeje suavemente três mililitros de cloreto de césio de baixa densidade.
A suspensão da partícula adenoviral do lysato celular ou do meio de cultura é então sobreposta em cima do gradiente. Os tubos são preenchidos com óleo mineral e introduzidos nos baldes SW41. Após o equilíbrio, os tubos são carregados simetricamente no rotor, que é introduzido no ultracentrifuge.
A centrífuga funciona a 35.000 RPM e quatro graus por 18 horas sem pausa. Após a ultracentrifugação, os tubos são colocados em um suporte com um papel preto atrás, a fim de colher as bandas. A fase superior clara e os detritos celulares são descartados em um recipiente de resíduos com uma solução de branqueamento.
A faixa mais baixa contendo o adenovírus completo é colhida com uma ponta de pipeta e coletada em um tubo Eppendorf estéril. Após a diálise, a sacarose é adicionada à suspensão viral a uma concentração final de 4% e a alíquota viral é mantida congelada a menos 80 graus. Na seção de resultados, mostramos a expressão GFP em células transduzidas com o adenovírus obtido.
48 horas após a transdução, o GFP é expresso pelas células transduzidas, como mostrado pela microscopia de fluorescência. A porcentagem das células expressas do GFP é determinada pela citometria de fluxo. Cerca de 50% das células endoteliais humanas e bovinas transduzidas com 25 unidades de transdução por célula são positivas por GFP.
O mesmo rendimento de transdução foi obtido para hepatocitos murinos quando foram utilizadas apenas cinco unidades de transdução por célula, mas isso está associado à maior mortalidade devido à sensibilidade celular. Reduzido à expressão GFP foi obtido pela transdução de células estromais mesenquimais devido à baixa expressão dos receptores específicos. Observações finais.
Otimizamos essas tecnologias laboriosas para reduzir o tempo, os custos e o esforço necessário para obter as partículas adenovirais. O adenovírus preparado é capaz de infectar vários tipos de células e induzir a expressão do gene de interesse.
