Os autores agradecem ao Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa por sua ajuda com o desenvolvimento deste protocolo. Reconhecemos o apoio por doações da caridade Great Ormond Street Hospital, a Fundação Eugenio Litta (Genebra, Suíça), o Conselho de Pesquisa Médica, o Colégio Real de Cirurgiões da Inglaterra, as faíscas Infantil Medical Caridade, o Ministério do Exterior britânico para o Reino Unido / EUA Stem Cell Collaboration Award e ao Fundo de Investigação Mittal. Gostaríamos também de agradecer à Fundação Royal Society / Wolfson para a engenharia de tecidos concessão remodelação laboratório obtidos para o Departamento de Cirurgia Pediátrica do Instituto de Saúde da Criança. PDC e SE são suportados por caridade o Great Ormond Street Hospital da Criança.

1. Isolamento de Rato Intestino <ol><li> Prepara-se uma solução de 1 L de salina tamponada com fosfato (Sigma, Reino Unido) com 1% de antibiótico / antimicótico (Sigma, Reino Unido) (PBS / AA). Coloque a bomba peristáltica (velocidade variável Masterflex L / S) com dois tubos. Executar etanol a 70% (EtOH), através dos tubos da bomba peristáltica durante 15 minutos à velocidade máxima, seguido de PBS / AA por mais 15 min. </li><li> Eutanásia adultos ratos Sprague-Dawley pesando aproximadamente 250-350 g por inalação de CO 2 e deslocamento cervical, de acordo com as diretrizes locais de origem animal e aprovações (no Reino Unido, as orientações do Ministério do Interior sob os Animais (Scientific Procedures) Act 1986). </li><li> Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes de usar. Spray e limpe o abdômen do animal usando etanol 70%. </li><li> Realizar uma incisão laparotômica xifo-púbica no abdômen para garantir um campo cirúrgico claro. </li><li> Eviscerar do intestino delgado, no lado direito do animal sobre uma toalha de papel pulverizado com 70% de EtOH. Take cuidado para molhar continuamente o intestino com PBS / AA, de modo a evitar a desidratação do tecido e a desnaturação da matriz extracelular (ECM). </li><li> Localizar a artéria mesentérica superior (SMA) provenientes de um ângulo de 90 ° a partir da aorta para o intestino. Usar um G cânula 27 para entrar no SMA da aorta e rapidamente retirar a agulha para evitar rasgar a parede do vaso. Avançar o tubo plástico da cânula para a SMA e segura usando suturas (Vicryl 5/0). </li><li> Confirme punção, injetando 1 ml de PBS / AA. Use uma tesoura de mola para o inciso proximal aorta e distal à SMA, de modo a liberar a cânula. </li><li> Para evitar a fuga das fezes quando dissecando o intestino grosso, coloque um (seda 5/0) nó de sutura na extremidade proximal da junção ileocecal e uma na extremidade distai do cólon sigmóide. Em seguida, retira o íleo terminal e dois pontos entre as duas cabeças e remover o intestino grosso. </li><li> Cortar o intestino no jejuno-duodenal junção umaª liberar o intestino de qualquer conexão do tecido conjuntivo que pode ter com o abdômen. </li><li> Transferir o intestino delgado em uma placa de Petri com PBS / AA. Canular seção proximal do intestino com uma pipeta Pasteur de plástico (LSL Laboratório de consumíveis) e fixá-lo no lugar com suturas. Corte a pipeta por isso vai caber a Luer-Lok de uma seringa de 60 ml (BD Plastipak). Lave o lúmen intestinal 2x com 60 ml de PBS / AA para remover fezes e detritos. </li></ol> 2. Metodologia Decelularização <ol><li> Conecte a cânula vascular a um torneira de três vias. Isto irá facilitar o manuseamento, a minimizar a tensão sobre a árvore vascular e permitir a remoção de bolhas a partir da tubagem. </li><li> Comece a correr água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) através da bomba de roletes de velocidade variável Masterflex L / S de 0,6 ml / h. Garantir que não haja bolhas de ar dentro do tubo antes de se conectar com a torneira lúmen intestinal. Algumas bolhas podem estar presentes dentro do lúmen do passo1.9, o que pode prejudicar o processo de decelularização. Variar a velocidade da bomba e manipular o tecido com uma pinça com cuidado para garantir que a saída de bolhas a partir da extremidade distal. Não conecte a cânula vascular até que esse processo for concluído, uma vez altas velocidades pode danificar a árvore vascular. </li><li> Transferir para o aparelho de câmara fria, uma vez que o passo seguinte de descelularização é realizada a 4 ° C. A baixa temperatura permite a remoção de células, minimizando a decomposição do tecido. Coloque a placa de Petri em um recipiente que irá recolher a solução transbordante. Perfundir ambos os lúmen intestinal e a árvore vascular com água deionizada (resistividade 18,2 mohms / cm) durante 24 horas a 0,6 ml / h. Para conferir a primeira hora o aparelho regularmente para garantir que todas as ligações são seguras, o vazamento é mínima e sem bolhas estão presentes no intestino. </li><li> Após 24 horas de tratamento com água deionizada, mova aparelho decellularization fora da sala fria, como o resto dos passos sãorealizada em temperatura ambiente (RT). </li><li> Pesar o desoxicolato de sódio (Sigma, Reino Unido) para preparar 300 ml de uma solução 4% em água desionizada. Pesar o desoxicolato de sódio, sob uma capa de sucção, uma vez que é um agente irritante oral e olho. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. A solução pode ser mantida a 4 ° C durante até 1 mês. </li><li> Altere a solução deionizada para desoxicolato de sódio, verifique as conexões, remover quaisquer bolhas e perfuse em 0,6 ml / h durante 4 h. </li><li> Seguindo o passo de lavagem com PBS, o desoxicolato de sódio / AA por 30 minutos para evitar a interacção entre o desoxicolato de sódio e de DNase I. </li><li> Pesar desoxirribonuclease-I (DNase I, Sigma) e preparar 250 ml de uma solução 2,000 kU em cloreto de sódio 1 M, pH 7,4. Misturar utilizando um vortex até que a solução é límpida. Esta solução deve ser preparado imediatamente antes da utilização e não pode ser armazenado. </li><li> Perfundir com ADNase-I, durante 3 horas à temperatura ambiente a uma velocidade de 0,6 ml / hr. </li><li> Seguindo o passo de DNase I, transferir oscaffold num capuz de cultura de tecidos e alteração placas ou instrumentos. Sugere-se usar uma técnica asséptica. </li><li> Lavar com PBS / AA por 30 min para assegurar que todos os restos das soluções decelularização são removidos. Coloque o andaime em uma nova placa de Petri e transferir para um Crosslinker UV (Spectroline, EUA). Execute dois ciclos de esterilização. Guarde em 5% PBS / AA e alterar a solução a cada 3 dias. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

As etapas mais difíceis na criação deste experimento envolve a punção da SMA e do estabelecimento e manutenção de esterilidade. Canulação da SMA em roedores sem romper a parede pode ser bastante difícil devido ao tamanho ea posição do navio. Alternativamente, um fio de sutura pode ser colocada ao redor da aorta proximal antes da origem SMA, seguido por canulação da própria aorta distais, dirigindo a cânula de plástico para a SMA. Durante decellularization uma combinação de colocação de cânula pobres e altas taxas de fluxo pode resultar na perda do acesso vascular. A esterilidade é um problema importante, devido à quantidade da flora bacteriana do intestino delgado. A lavagem com PBS / AA a seguir à colheita é muito importante, e qualquer sinal de matéria fecal ou restos deve ser removido a partir do lúmen. Colocar uma porção do andaime num tubo Falcon com DMEM na incubadora após a esterilização de UV deverá ser um indicador se esterilidade foi alcançado. No casode colonização bacteriana, a mídia vai mudar o pH com a sua cor passando de vermelho para amarelo. Para lidar com isto, ciclos adicionais de UV são aconselhados, bem como a lavagem com PBS, contendo uma elevada concentração de antibiótico / antimicótico. Uma modificação possível obter um andaime com acesso tanto vascular venoso e seria canular a veia cava inferior (IVC), bem como a SMA. Decelularização dos lados venosos e vasculares deve ser tentada de forma intermitente para as três soluções. Decellularization contínua pode estourar os vasos capilares fazendo com que a pressão positiva em ambos os lados. Ao longo dos anos, tem havido uma série de esforços no intestinal TE usando diferentes combinações de células-andaime in vitro e in vivo 6,9,12. A maioria dos trabalhos foi realizada utilizando tubulares não tecido 95% PGA-5% PLGA andaimes revestidos com colágeno tipo I 6,7,13,22. Após a sementeira com intestinalunidades epiteliais organóide (OU) e um período de implantação no omento de ratinhos, que formam cistos com músculo do lado de fora e do epitélio por dentro, que pode então ser tubulares. No entanto, a porosidade e a simplicidade na concepção destas estruturas não permite a geração de grandes pedaços de intestino artificial, em um ambiente in vitro, tais como a de um bio-reactor. Além disso, a falta de uma rede vascular inata, que pode ser conectado ao recipiente limita ainda mais o uso de este andaime para tradução clínica. Além dos experimentos com os andaimes PGA-PLGA, outros grupos têm usado de colágeno ou SIS andaimes, sendo que ambos não replicar a complexidade do trato intestinal. SIS em particular, é a única metodologia publicada anterior de engenharia de tecido intestinal e tem sido usado em mais de 150 ambientes médicos, demonstrando a capacidade de andaimes descelularizados para proporcionar estabilidade mecânica e promover o crescimento celular, enquanto chumboção de resposta imunogênica. No entanto, a falta de macro-e micro-arquitetura apropriada, levou a resultados ruins em sua &quot;utilização para fins TE intestinais 9-11,23. Os benefícios da metodologia de descelularização temos descritos incluem a preservação das características microscópicas, tais como a arquitectura cripta-vilosidade luminal que representam um ambiente adequado para o repovoamento do nicho de células estaminais intestinal. No aspecto macroscópico, a presença de uma rede vascular hierárquica irá permitir ligação ao recipiente, permitindo fornecimento de nutrientes e oxigénio para toda a camada de a-TE intestino 21. Além disso, a manutenção de componentes da matriz extracelular, como colágeno, elastina e glyocosaminoglycans tem um papel importante não só para as características mecânicas, mas também dirigir proliferação e diferenciação celular. Mais importante, a capacidade de a metodologia de descelularização de ser melhorados em grander tecidos, enquanto mantendo as mesmas características é uma característica importante para a tradução clínica da TE. O desenvolvimento de uma matriz intestinal natural com uma rede vascular permite a criação de grandes segmentos do intestino artificial, que pode ser ligado ao hospedeiro.

A engenharia de tecidos (TE) oferece uma alternativa terapêutica ao transplante de órgãos, ignorando questões de imunossupressão e escassez de órgãos. TE teve, recentemente, aplicações bem sucedidas na clínica, com a substituição de órgãos como a bexiga 1, 2 uretra e traquéia, tanto em adultos 3,4 e crianças 5. Construção de um órgão de engenharia de tecidos, requer a combinação de um andaime, com as células apropriadas. Um andaime pode ser preparado usando de origem natural (por exemplo, colagénio) e (por exemplo, ácido poli-L-glicólico; PLGA) sintética materiais, ou ser obtido através da descelularização de órgãos e de tecidos nativos. Os andaimes que têm sido utilizados até agora para TE intestinais têm sido principalmente quer descelularizado (submucosa de intestino delgado) ou sintético (ácido poli-L-ácido glicólico e ácido poli-láctico) 6-13. Estes biomateriais são muito simples, tanto macro-e micro-arquitetura, quepode não ser ideal se intestino engenharia de tecidos deve ser traduzido clinicamente. Um biomaterial ideal para o intestino deve ter uma árvore vascular inata, que pode ser conectado ao fornecimento de sangue do hospedeiro, de uma parede tubular de camadas com diferentes propriedades de modo a reflectir as camadas da parede intestinal e um eixo vilo-cripta no lado luminal para auxiliar com repovoamento de células estaminais epiteliais. Decelularização é uma nova metodologia que produz andaimes, removendo as células de órgãos inteiros, mantendo sua arquitetura original 14. Isto é preferível para andaimes já existente, uma vez que não só a mesma estrutura do órgão, mas também contêm sinais químicos incorporados no interior da matriz extracelular (ECM), que ajuda a proliferação e diferenciação celular. Em 2008, um traquéia cadavérico foi descelularizados 14, semeado com células do próprio paciente, e transplantadas para substituir brônquio principal esquerdo em um homem jovem <sup&gt; 3. Desde então, diversos grupos relataram a produção de andaimes descelularizados para o coração 15, 16,17 fígado, pulmão e 18-20 em animais pequenos e grandes. Nós também se adaptaram a mesma metodologia para produzir um pequeno andaime descelulada intestinal 21. O objectivo do método aqui descrito é para produzir matrizes intestinais descelularizados que mantêm as características macroscópicas do tecido original, tais como o fornecimento de sangue, bem como a arquitectura microscópica do eixo vilo-cripta no lúmen intestinal. Acreditamos que essa metodologia poderia finalmente ser adotado para outros órgãos para melhorar a eficiência de descelularização.

<table><tbody><tr><td>Ethanol solution, 70% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline tablets</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Oral and eye irritant; use protection</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

a decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix

Engenharia de tecidos bem sucedido envolve a combinação de andaimes com células adequadas in vitro ou in vivo. Os andaimes podem ser sintéticos, de origem natural ou derivados de tecidos / órgãos. Estes últimos são obtidos utilizando uma técnica chamada de descelularização. Descelularização pode envolver uma combinação de métodos enzimáticos física, química, e. O objetivo desta técnica é remover todos os vestígios de telefonia celular, mantendo a arquitetura micro-macro e do tecido original. Engenharia de tecidos intestinais, até agora utilizados andaimes relativamente simples que não reproduzem a arquitetura complexa do órgão nativo. O foco deste artigo é descrever uma técnica eficiente para decellularization rato intestino delgado. O isolamento do intestino delgado, de modo a assegurar a manutenção de uma ligação vascular é descrito. A combinação das soluções químicas e enzimáticas para remover as células whilª preservando o eixo vilosidade-cripta no aspecto luminal do andaime também está definido para fora. Finalmente, é discutida a avaliação de andaimes produzidos para as características apropriadas.

Após a descelularização bem sucedida (Figura 1), o andaime deve ter uma aparência macroscópica semelhante ao do intestino nativo, mas com paredes translúcidas (Figura 2A). A preservação da macro-arquitetura também deve ser evidente por a desobstrução da árvore vascular. Quando corante é injectado através da cânula da SMA, ele deve distribuir uniformemente por todo o andaime e atingir a árvore capilar (Figura 2B). O andaime deve estar livre de material nuclear e citoplasmática, algo que pode ser avaliada através de um kit de quantificação de DNA e análise histológica simples. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) deve demonstrar a ausência de material nuclear e citoplasmática, preservando as pequenas camadas intestinais (Figura 3A). Em particular, a manutenção das criptas e vilosidades do lado luminal deve ser evidente a seguir a microscopia electrónica de varrimento (Figura 4). Aconservação de componentes da matriz extracelular, tais como o colagénio, a elastina e os glicosaminoglicanos também deve ser esperado. Por exemplo, de tricromo Masson exibe tecido conjuntivo intacto no andaime (Figura 3B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Plano Experimental Timeline do procedimento decellularization; PBS / AA: tampão fosfato com antibiótico-antimicótico, NaDeoxy: desoxicolato de sódio, RT: temperatura ambiente, DNAse-I: desoxirribonuclease-I. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Andaime macroscopic características. aparência macroscópica do intestino delgado de ratos após decellularization sucesso (A). A injeção de Rosso Ponceau corante através da SMA demonstra uma rede vascular intacto (B); SMA: artéria mesentérica superior <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. . Histologia H &amp; E (A) e MT (B) coloração indicam uma ausência de material celular com a preservação da arquitetura do tecido conjuntivo; H &amp; E: hematoxilina e eosina, MT: Masson. Barra de escala:. 100 mm <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . </p&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. . Microscopia eletrônica de Microscopia Eletrônica de Varredura indica a arquitetura das vilosidades-crypt preservada no lúmen andaime; Barra de escala:. 100 mm <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K visualizações.  University College London.  O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas. 

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Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Biologia do Desenvolvimento

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and composition. It is based on a microsurgical procedure designed to catheterize the trachea and aorta of a euthanized mouse to perfuse the heart and lungs with decellularizing agents. The decellularized cardiopulmonary complex can subsequently be immunostained to reveal the location of structural ECM proteins. The whole procedure can be completed in 4 days.
The ECM scaffolds resulting from this protocol are free of dimensional distortions. The absence of cells enables structural examination of ECM structures down to submicron resolution in 3D. This protocol can be applied to healthy and diseased tissue from mice as young as 4-weeks old, including mouse models of fibrosis and cancer, opening the way to determine ECM remodeling associated with cardiopulmonary disease.

This protocol aims to decellularize the heart and lungs of mice. The resulting extracellular matrix (ECM) scaffolds can be immunostained and imaged to map the location and topology of their components.

Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Pesquisa do câncer

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components are presented as a surface coating. These culture systems constitute a simplification of the complex nature of the tissue ECM that encompasses biochemical composition, structure, and mechanical properties. To better emulate the ECM-cell communication shaping the cardiac microenvironment, we developed a protocol that allows for the decellularization of the whole fetal heart and adult left ventricle tissue explants simultaneously for comparative studies. The protocol combines the use of a hypotonic buffer, a detergent of anionic surfactant properties, and DNase treatment without any requirement for specialized skills or equipment. The application of the same decellularization strategy across tissue samples from subjects of various age is an alternative approach to perform comparative studies. The present protocol allows the identification of unique structural differences across fetal and adult cardiac ECM mesh and biological cellular responses. Furthermore, the herein methodology demonstrates a broader application being successfully applied in other tissues and species with minor adjustments, such as in human intestine biopsies and mouse lung.

The cardiac extracellular matrix (ECM) is a complex network of molecules that orchestrate key processes in tissues and organs while enduring physiological remodeling throughout life. Standardized decellularization of fetal and adult hearts permits comparative experimental studies of both tissues in a 3D context by capturing native architecture and biomechanical properties.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Bioengenharia

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various cellular processes. Two-dimensional (2D) cell culture models oversimplify the complex interactions between cells and the ECM, as the lack of a complete three-dimensional (3D) support can alter cell behavior, making them inadequate for understanding in vivo processes. Deficiencies in ECM composition and cell-ECM interactions are important contributors to a variety of different diseases. 
One example is LAMA2-congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD), where the absence or reduction of functional laminin 211 and 221 can lead to severe hypotony, detectable at or soon after birth. Previous work using a mouse model of the disease suggests that its onset occurs during fetal myogenesis. The present study aimed to develop a 3D in vitro model permitting the study of the interactions between muscle cells and the fetal muscle ECM, mimicking the native microenvironment. This protocol uses deep back muscles dissected from E18.5 mouse fetuses, treated with a hypotonic buffer, an anionic detergent, and DNase. The resultant decellularized matrices (dECMs) retained all ECM proteins tested (laminin &#945;2, total laminins, fibronectin, collagen I, and collagen IV) compared to the native tissue. 
When C2C12 myoblasts were seeded on top of these dECMs, they penetrated and colonized the dECMs, which supported their proliferation and differentiation. Furthermore, the C2C12 cells produced ECM proteins, contributing to the remodeling of their niche within the dECMs. The establishment of this in vitro platform provides a new promising approach to unravel the processes involved in the onset of LAMA2-CMD, and has the potential to be adapted to other skeletal muscle diseases where deficiencies in communication between the ECM and skeletal muscle cells contribute to disease progression.

In this work, a decellularization protocol was optimized to obtain decellularized matrices of fetal mouse skeletal muscle. C2C12 myoblasts can colonize these matrices, proliferate, and differentiate. This in vitro model can be used to study cell behavior in the context of skeletal muscle diseases such as muscular dystrophies.

Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produção de fibras da matriz extracelular através de cultura de células de membrana de fibra oca Sacrificial

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

Decellularization for the Preparation of Highly Preserved Human Acellular Skin Matrix for Regenerative Medicine

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of surrounding cells due to its content of diverse bioactive molecules. Due to these characteristics, the ECM has been recently considered a promising candidate for the creation of biological scaffolds to boost tissue regeneration. Emerging studies have demonstrated that decellularized human tissues could resemble the native ECM in their structural and biochemical profiles, preserving the three-dimensional (3D) architecture and the content of fundamental biological molecules. Hence, decellularized ECM can be employed to promote tissue remodeling, repair, and functional reconstruction of many organs. Selecting the appropriate decellularization procedure is crucial to obtain acellular tissues that retain the characteristics of the ideal microenvironment for cells. 
The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the decellularization method to obtain a reproducible and effective cell-free biological ECM. Skin fragments from patients undergoing plastic surgery were scaled down and decellularized using a combination of sodium dodecylsulfate (SDS), Triton X-100, and antibiotics. To promote the regular and homogeneous transport of the solution through the samples, they were enclosed in embedding cassettes to ensure protection from mechanical insults. After the decellularization procedure, the snow-white color of skin fragments indicated complete and successful decellularization. Additionally, decellularized samples showed an intact and well-preserved architecture. The results suggest that the proposed decellularization method was effective, fast, and reproducible and protected samples from architectural damages.

Decellularized human skin is suitable for tissue regeneration. A major issue of decellularization is the preservation of the native architecture, along with the appropriate content of structural proteins, glycosaminoglycans (GAGs), and growth factors. The method proposed allows fast and effective decellularization, producing decellularized skin with well-preserved native features.

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of ...

Efeitos epiteliais da inflamação intestinal em colonoides murinos estabelecidos

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autor em destaque: estudando os efeitos epiteliais da inflamação intestinal in vitro em colonoides murinos estabelecidos  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...