Quantitação do vírus da raiva em várias estruturas cerebrais bovinas. O México é um país com considerável potencial pecuário. Os estados com maior produção pecuária contêm regiões tropicais úmidas e regiões secas que estão em risco de surtos de raiva devido à presença do morcego vampiro, Desmodus rotundus, o principal transmissor da raiva.
A detecção do gene n nucleoproteína do vírus da raiva é usada principalmente para o diagnóstico de raiva por testes moleculares. Usando abordagens baseadas em PCR, quantidades mínimas de um agente infeccioso podem ser detectadas em uma amostra clínica através da amplificação seletiva e repetitiva de uma sequência de nucleotídeos de DNA. qRT-PCR baseia-se na detecção e quantificação de uma molécula onde os aumentos do sinal de fluorescência são em proporção direta à quantidade de produto PCR em uma única reação.
À medida que o número de cópias do alvo do ácido nucleico aumenta, a fluorescência também aumenta. Com base nisso, o objetivo do estudo foi utilizar qRT-PCR quantitativo para determinar o número de partículas virais em diferentes estruturas anatômicas do cérebro bovino, após a morte, devido à infecção por raiva. O RNA total foi extraído diretamente de cérebros bovinos usando um método de extração orgânica de acordo com o protocolo a seguir.
Use 100 miligramas de tecido cerebral de cada estrutura anatômica para extrair RNA total usando um reagente comercialmente disponível contendo isoticianato de guanidinium. Homogeneize manualmente um total de 100 miligramas de tecido de cada estrutura em um mililitro do reagente isothiocianato guanidinium por vórtice usando um homogeneizador Dounce com um pequeno pilão dentro do microtube por 15 segundos em velocidade máxima. Incubar as amostras no gelo por cinco minutos e, em seguida, adicionar 200 microliters de clorofórmio.
Misture as amostras vigorosamente por 15 segundos. Incubar no gelo por dois a três minutos, e depois centrífugas a 12.000 x g por 15 minutos a quatro graus centígrados. Transfira a fase aquosa para um tubo limpo e adicione 500 microliters de álcool isopropílico.
Incubar as amostras por 15 minutos a 21 graus centígrados. Centrifugar as amostras a 12.000 x g durante 10 minutos a quatro graus centígrados. Aspire o supernatante aquoso por pipetação.
O RNA isolado estará presente como uma pelota no tubo. Em seguida, lave a pelota de RNA com um mililitro de 75% de etanol por pipetação e centrífuga a 7.500 x g por cinco minutos a quatro graus centígrados. Decante o supernasce e o ar seque a pelota de RNA à temperatura ambiente, 21 graus centígrados.
Em seguida, diluir a pelota em 50 microliters de água sem nuclease. Determine a concentração e qualidade do RNA em 260 nanômetros usando um espectotômetro. A transcrição in vitro gera mRNA de um gene alvo.
Use um par de primer que amplifica o gene RABV N completo, e um que é usado como um controle positivo para o ensaio qRT-PCR. Estes primers são projetados para amplificar o gene RABV N completo, e para adicionar um promotor que reconhece a polimerase T7. Para amplificar todo o gene N RABV, use os primers trans e RAB para frente e para trás, e um kit PCR de alta fidelidade.
Para cada reação, prepare uma mistura mestre pcr adicionando a um tampão de reação de tubo PCR limpo com 10 micromolar de cada primer e 0,5 unidades de polimerase de alta fidelidade. Para usar o produto PCR como modelo para a síntese in vitro e remover componentes da reação enzimática, purifique o produto PCR usando um kit concentrador baseado em coluna, de acordo com as instruções do fabricante. E, em seguida, quantificar usando um espectrofotômetro.
Para síntese de RNA, use um kit de transcrição in vitro com a seguinte mistura de reação: cinco microliters T7 transcription 5X buffer, 1.9 microliters de cada nucleotídeo triphosfato, 10 microgramas de DNA RABV N purificado e 2,5 microliters da mistura enzimática. Em seguida, incubar a mistura a 37 graus centígrados por quatro horas. Em seguida, adicione um microliter de uma unidade por micrograma Rnase-Free DNase à mistura de reação e incubar por 15 minutos a 37 graus centígrados para eliminar a contaminação do DNA.
Purifique o RNA transcrito in vitro e, em seguida, concentre-o usando fenol:clorofórmio:álcool isoamyl a uma proporção de 25:24:1. Resuspenque a pelota de RNA purificada em 70 microliters de tampão de TE e, em seguida, armazene-a a 80 graus centígrados até usar. Repita o protocolo PCR até obter aproximadamente cinco microgramas de produto PCR.
Após a purificação e concentração, o mRNA de gene N in vitro transcrito estará presente em uma concentração de 4.711 microgramas por microliter. Confirme que o mRNA transcrito in vitro corresponde ao gene N após o passo cinco deste protocolo, e use-o como um controle positivo para a reação em cadeia de transcriptase reversa em tempo real, qRT-PCR. Para reação em cadeia de transcriptagem reversa em tempo real, use uma transcrição in vitro mRNA na codificação do gene N completo como um controle positivo.
Juntamente com um kit comercial de um passo qRT-PCR, usando sondas de hibridização de acordo com as instruções do fabricante. Use a sonda em primers descritos por Coronado e seu colega de trabalho 2010 para detectar uma região conservada do RABV usando as seguintes condições de ciclismo térmico. Realize diluições seriais do mRNA transcrito in vitro, pipetando em série um micrograma por microcompleta de mRNA em tubos até que seis diluições dissociadas sejam obtidas.
Prepare tubos a um volume de 100 microliter em triplicado para uso na criação da curva padrão. Execute qRT-PCR conforme descrito anteriormente. Execute qRT-PCR em um cicloviário térmico com um rotor processando as várias amostras cerebrais simultaneamente com as reações em execução para criar uma curva padrão e usar controles positivos, controles negativos e supernantes isolados da cultura celular.
Para avaliar o limite de detecção, eficácia do teste e sensibilidade do teste, utilize uma curva padrão em triplicado sob as mesmas condições. Para a detecção do gene N rabv, use o RNA a partir de amostras de campo, controles positivos, controles negativos e supernantes de cultura celular para realizar qRT-PCR usando o kit PCR descrito anteriormente. Para determinar o número de cópias do genoma RABV presente nas amostras do cérebro bovino, obtenha dados de TC da curva padrão e amostras biológicas, e daqueles interpolados da equação da curva de calibração Esta figura mostra tecidos cerebrais bovinos exibindo coloração positiva de acordo com a imunofluorescência direta.
Os resultados mostram 100%100%83,3%66% e 50% de positividade para RABV no córtex, tálamo, medula, pons e chifre, respectivamente. Esses resultados confirmam os resultados anteriores, e pelo menos três das estruturas dissecadas de cada cérebro foram positivas para o RABV. Por outro lado, a equação da curva padrão mostra a relação entre a quantidade de conteúdo genético RABV na amostra e o tamanho do fragmento amplificado pcr.
A quantidade de teor genético de RABV em nanogramas foi deduzida pela interpolação dos valores da TC na curva de calibração utilizando a equação apresentada nesta figura. Usando esta equação, o limite de detecção de uma vez 10 a o quinto microgramas por microliter de RNA viral foi encontrado correspondendo a 36 cópias do genoma RABV. Esses resultados demonstram que o ensaio é sensível e pode ser usado para detectar o vírus em amostras que contêm um baixo número de cópias do gene RABV N.
A eficiência do ensaio foi calculada utilizando-se a inclinação da curva padrão, que foi de 3,28. As amostras utilizadas para qRT-PCR mostraram amplificação do gene RABV N. Para determinar o número de cópias virais presentes, os valores de tomografia de cada amostra foram interpolados utilizando-se a equação da curva de calibração.
Os resultados obtidos em nanogramas foram substituídos na fórmula aqui descrita. Esta tabela mostra os resultados comparativos entre qRT-PCR e DFA. Os resultados dos ensaios qRT-PCR foram consistentes com os obtidos utilizando DFA.
De acordo com os resultados obtidos no teste qRT-PCR nos casos C e D, o tálamo é a estrutura que possui o maior número de cópias do gene RABV N. Isso sugere que a infecção precoce de neurônios hipotálamo e talámicos é importante no desenvolvimento da doença, uma vez que esses neurônios controlam as funções vegetativas de um animal. Os números de cópia do gene RABV N que foram detectados em cada estrutura de cada amostra são: a sensibilidade e a especificidade do teste qRT-PCR estamos 100% como todas as amostras foram positivas.
Este resultado é consistente com os diagnósticos iniciais das amostras. qRT-PCR é uma técnica altamente sensível. Alguns dos passos são fundamentais para obter os melhores resultados.
Uma delas é o manuseio adequado de amostras para extração de RNA. Este passo é crucial, pois o RNA é facilmente degradado e, portanto, os resultados podem ser afetados. Considere manter a amostra em condições frias, aproximadamente quatro graus centígrados durante o processo.
Além disso, considere que várias rodadas de aplicação pcr são realizadas como mencionado na transcrição in vitro. O ensaio qRT-PCR realizado neste estudo pôde detectar apenas 36,3 cópias do gene RABV N por miligrama de tecido. As estruturas cerebrais mais adequadas para qRT-PCR incluíram o córtex e o tálamo.
Isso se baseia nas observações de que foram detectadas maiores concentrações do gene RABV N nessas estruturas, e que também foram encontradas positivas utilizando-se o teste de referência RABV. O teste foi capaz de detectar concentrações muito baixas, 0,00023 vezes 10 a nona cópias do vírus em várias amostras. Além de quantificar as partículas virais na amostra, o teste parece fornecer uma boa ferramenta alternativa de diagnóstico e pesquisa para a detecção de RABV aqui apresentado.
