狂犬病病毒在各种牛脑结构中的量化。墨西哥是一个具有巨大牲畜潜力的国家。畜牧业产量最高的州包括潮湿的热带地区和干旱地区，由于存在狂犬病的主要传播者德斯莫杜斯·罗通杜斯，因此面临狂犬病爆发的风险。
狂犬病病毒核蛋白N基因的检测主要用于通过分子测试诊断狂犬病。使用基于 PCR 的方法，通过选择性和重复性放大 DNA 核苷酸序列，可以在临床样本中检测到少量传染性剂。qRT-PCR 基于荧光信号增加与单个反应中 PCR 产品量成正比的分子的检测和定量。
随着核酸靶的拷贝数量增加，荧光也增加。在此基础上，该研究的目的是使用定量qRT-PCR来确定牛脑不同解剖结构中因狂犬病感染而死亡后病毒颗粒的数量。根据以下协议，使用有机萃取方法直接从牛脑中提取RNA总量。
使用从每个解剖结构中提取 100 毫克脑组织，使用含有异氰酸硅酸钛的市售试剂提取总 RNA。通过使用Dounce同质化剂在微管内以最大速度在微管内用小虫子旋转15秒，手动均匀地将每个结构中的100毫克组织同质化。将样品在冰上孵化五分钟，然后加入200微升氯仿。
将样品大力混合15秒。在冰上孵化两到三分钟，然后在12，000 x g的离心机中孵育15分钟，在四摄氏度。将水相转移到干净的管子上，并加入500微升异丙醇。
在21摄氏度下将样品孵化15分钟。在4摄氏度下，将样品在12，000 x g下分化10分钟。通过管道吸气的水性超自然。
孤立的RNA将作为弹丸在管中存在。接下来，用一毫升75%乙醇清洗RNA颗粒，在7，500 x g的管道和离心机中，在4摄氏度下5分钟。在室温下，在21摄氏度的室温下，将超自然体和空气干燥RNA颗粒。
接下来，在50微升无核糖水中稀释颗粒。使用光谱仪确定 260 纳米的 RNA 浓度和质量。体外转录产生目标基因的mRNA。
使用放大完整RABV N基因的引言对，以及用作 qRT-PCR 检测正控的引言对。这些引物旨在放大完整的RABV N基因，并添加一个促进剂，识别T7聚合酶。要放大整个 N 基因 RABV，请使用引座反向和反向和反向引子，以及高保真 PCR 套件。
对于每个反应，通过添加一个干净的PCR管反应缓冲器，每个引物的10微摩尔和0.5单位的高保真聚合酶，准备PCR主混合。要使用 PCR 产品作为体外合成的模板，并去除酶反应的组件，请根据制造商的说明，使用基于柱的浓缩器套件净化 PCR 产品。然后使用光谱仪进行量化。
对于RNA合成，使用体外转录套件与以下反应混合物:5微升T7转录5X缓冲器，1.9微升每个三磷酸核苷酸，10微克纯化RABV NDNA，和2.5微升酶混合物。接下来，在37摄氏度的高温下孵育混合物4小时。然后，在反应混合物中加入每微克无Rnase DNase的一个单位的微升，在37摄氏度下孵育15分钟，以消除DNA污染。
净化体外转录RNA，然后用酚:氯仿:异酰醇以25:24:1的比例浓缩。将纯化的RNA颗粒重新插入70微升TE缓冲器，然后将其储存在80摄氏度，直到使用。重复 PCR 协议，直到获得大约 5 微克的 PCR 产品。
经过净化和浓缩后，体外转录的N基因mRNA将以每微升4.711微克的浓度存在。确认体外转录的 mRNA 与本协议第五步之后的 N 基因对应，并以此作为实时反转转录聚合酶链反应 qRT-PCR 的正控制。对于实时反向转录聚合酶链反应，在编码完整的N基因时使用体外mRNA转录作为正控制。
以及商用的一步式 qRT-PCR 套件，根据制造商的说明使用混合探头。使用科罗纳多和同事 2010 描述的引物中的探头，使用以下热循环条件检测 RABV 的保存区域。通过将 mRNA 的每微升 1 微克串行管道输送到管中，直到获得六个脱钩稀释，对体外转录的 mRNA 进行连续稀释。
以三脚架的 100 微升体积准备管子，用于创建标准曲线。执行前述的 qRT-PCR。通过同时处理各种大脑样本和创建标准曲线的运行反应，并使用与细胞培养分离的正控制、负对照和超分子，在带转子的热循环器中执行 qRT-PCR。
要评估检测的极限、测试有效性和敏感性，请在相同条件下使用三位一体的标准曲线。要检测RABV基因N，请使用来自现场样本、阳性对照组、负对照组和细胞培养超纳特的RNA使用之前描述的PCR套件执行qRT-PCR。为了确定牛脑样本中RABV基因组的拷贝数量，从标准曲线和生物样本中获取CT数据，并从校准曲线方程中插值的CT数据中获取此图显示牛脑组织根据直接免疫荧光显示阳性染色。
结果表明，RABV在皮层、沙丘、美杜拉、庞氏和角中的阳性分别为100%100%83.3%66%和50%。这些结果证实了先前的结果，从每个大脑中解剖出的结构中至少有三个对RABV呈阳性。另一方面，标准曲线的方程显示了样本中RABV遗传成分的数量与PCR放大片段大小之间的关系。
纳米图中的RABV遗传含量是通过使用图中所示的方程对校准曲线中的CT值进行插值推断推断的。利用这个方程，检测限量为每微升病毒RNA的1倍10至5微克，相当于RABV基因组的36个拷贝。这些结果表明，检测是敏感的，可用于检测病毒的样本中含有少量的RABV N基因副本。
检测效率使用标准曲线的斜率计算，即 3.28。用于 qRT-PCR 的样本显示了 RABV N 基因的放大。为了确定病毒拷贝的数量，使用校准曲线方程对每个样本的 CT 值进行插值。
以纳米语法获得的结果被替换到此处描述的公式中。此表显示了 qRT-PCR 和 DFA 之间的比较结果。qRT-PCR 检测结果与使用 DFA 获得的检测结果一致。
根据在 QRT-PCR 测试中在 C 和 D 病例中获得的结果，塔拉穆斯是拥有 RABV N 基因拷贝数量最多的结构。这表明，鉴于这些神经元控制着动物的植物功能，下丘脑和地中海神经元的早期感染对疾病的发展很重要。在每个样本的每个结构中检测到的RABV N基因的拷贝编号是:qRT-PCR测试的灵敏度和特异性，我们都100%，因为所有样本都是阳性的。
此结果与样本的初始诊断一致。qRT-PCR 是一种高度敏感的技术。某些步骤对于获得最佳结果至关重要。
其中之一是正确处理RNA提取的样品。这一步骤至关重要，因为RNA很容易退化，因此结果可能会受到影响。考虑在寒冷条件下保持样品，在此过程中大约为摄氏四度。
此外，请考虑在体外转录中提及的几轮 PCR 应用。在这项研究中进行的qRT-PCR检测可以检测到每毫克组织RABV N基因的36.3个拷贝。qRT-PCR 最合适的大脑结构包括皮层和沙拉穆斯。
这是基于在这些结构中检测到RABV N基因浓度较高的观察结果，并且使用RABV参考测试也发现它们呈阳性。该测试能够检测出非常低的浓度，0.00023倍10至9份病毒在各种样本中。除了量化样品中的病毒颗粒外，该测试似乎为这里展示的RABV检测提供了一个很好的替代诊断和研究工具。
