Este protocolo é útil para determinar mudanças na ativação NF-kappa-B em células expressando um repórter de luciferase NF-kappa-B. A principal vantagem desta técnica é que permite uma tela de alto rendimento de fatores ou condições que levam a mudanças na ativação NF-kappa-B. NF-kappa-B é um fator de transcrição para uma grande variedade de processos celulares.
Uma função bem conhecida de NF-kappa-B está na indução de respostas inflamatórias induzindo a expressão de várias citocinas e quimiocinas. Nosso laboratório está particularmente interessado na indução de NF-kappa-B induzida pelo patógeno Salmonella typhimurium. Aqui, usamos a linha de células HeLa que é stably transfectada com um repórter de luciferase NF-kappa-B plasmid.
Outras bactérias, ou mesmo vírus ou compostos químicos, podem ser usadas nesta linha celular para estudar a ativação do NF-kappa-B. Outras linhas de celular também podem ser usadas se você puder introduzir tal NF-kappa-B repórter de luciferase plasmid nessa linha celular. Alguém fazendo isso pela primeira vez pode ter problemas utilizando corretamente a técnica estéril que é necessária para a cultura celular e o trabalho bacteriano.
Um dia antes da estimulação celular, remova a mídia de crescimento das células HeLa 57A que foram cultivadas para cerca de 75% de confluência. Lave as células com um mililitro de 0,05% de trippsina EDTA. Substitua por outro mililitro de trippsina EDTA e transfira o frasco para uma incubadora de 37 graus Celsius por cinco minutos.
Depois que as células foram separadas do frasco, suspenda-as em 10 mililitros de mídia de crescimento. Combine 10 microliters de suspensão celular com 10 microliters de azul Trypan, pipeta para cima e para baixo para misturar, e transfira 10 microliters para um slide de contador celular. Conte células em suspensão usando um contador celular, e use mídia de crescimento para diluir as células a uma concentração final de 2,5 vezes 10 para as cinco células por mililitro em um tubo cônico de 50 mililitros.
Transfira 250 microliters da suspensão celular para cada poço de uma placa de 48 poços. Tampe e vire periodicamente o tubo cônico para garantir uma suspensão celular homogênea. Toque suavemente na placa ao lado para garantir que as células distribuam uniformemente nos poços.
Transfira a placa para 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% e permita que as células se conectem e cresçam durante a noite. Estrias congeladas de Salmonella em placas de ágar LB para produzir colônias únicas. Transfira as placas para uma incubadora a 37 graus Celsius e permita o crescimento durante a noite.
No dia seguinte, adicione três mililitros de LB aos tubos de cultura bacteriana estéreis, e adicione antibióticos apropriados à mídia. Usando um laço de inoculação estéril, escolha uma única colônia das culturas bacterianas listradas e toque o laço para a mídia LB. Tampe os tubos após a inoculação e descarte o laço.
Coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius e 180 RPM, depois permita que as bactérias cresçam durante a noite. Pela manhã, recupere culturas bacterianas durante a noite da incubadora. Prepare tubos para subcultura adicionando três mililitros de LB frescos e antibióticos.
Transfira 30 microliters da cultura bacteriana da noite para o dia para a mídia recém-preparada. Coloque os tubos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação de três horas, transfira um mililitro de caldo LB estéril em uma cuvette de plástico para servir como o branco.
Transfira 900 microliters de LB para as outras cuvetas a serem utilizadas para a análise da amostra. Transfira 100 microliters de subcultura bacteriana para uma cuvette contendo 900 microliters de LB, e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Repita isso para cada suspensão bacteriana.
Ligue o espectótmetro para medir a densidade óptica das culturas bacterianas em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Coloque o branco no espectrômetro. Tome nota da orientação.
Feche a tampa e pressione o botão em branco no espectrômetro para obter a absorção de fundo. Substitua o cuvette em branco por uma colher de sopa na mesma orientação e pressione a leitura. Registo os valores OD600 dessas amostras.
Multiplique o valor por 10 para explicar o fator de diluição. Diluir a suspensão de 1 a 10 em uma cuvette e medir a absorvância, o que deve dar um valor de aproximadamente 0,1 que corresponde aproximadamente 1 vez 10 a nove UFC por mililitro. Em um novo tubo, adicione um volume apropriado da subcultura diluída à LB fresca para obter uma suspensão de uma vez 10 para a oito UFC por mililitro para ser usado como um inóculo.
Prepare diluições seriais do inóculo transferindo 50 microlitadores de suspensão bacteriana para um tubo contendo 450 microliters de PBS estéril até que uma diluição final de aproximadamente 100 UFC por mililitro seja feita. Transfira 100 microlitadores das duas diluições mais baixas, 100 e 1000 UFC por mililitro, para duas placas de ágar LB, e espalhe a suspensão com um espalhador de células para obter colônias únicas. Transfira essas placas para uma incubadora Celsius de 37 graus e incubar durante a noite.
No dia seguinte, conte as colônias e calcule a concentração bacteriana do inóculo inicial para determinar a concentração real do ânculo. No mesmo dia, rotule a tampa da placa de acordo com as condições de infecção que serão utilizadas para cada poço, com cada condição sendo feita em triplicado. Adicione 10 microlitadores do inóculo aos poços apropriados e adicione 10 microliters de LB estéreis a poços de controle não infectados.
Para sincronizar o tempo da infecção, coloque a placa em uma centrífuga de mesa e gire a 500 vezes G por cinco minutos, garantindo que a placa seja contrabalanceada. Em seguida, transfira as células infectadas para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por uma hora. Coloque um tubo cônico de 15 mililitros contendo uma alíquota de mídia de cultura celular em um banho de água de 37 graus Celsius para uso na próxima etapa.
Uma hora após o momento da infecção, remova o tubo cônico de 15 mililitros contendo mídia de cultura celular do banho de água e limpe o exterior com 70% de etanol. Transfira as placas de cultura tecidual da incubadora para um armário de biossegurança. Use dicas estéreis para aspirar mídia dos poços e substituir por 250 microliters de mídia fresca e quente da cultura celular.
Devolva as placas à incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por mais quatro horas. Depois disso, remova as placas da incubadora de dióxido de carbono e aspire a mídia dos poços. Para análise da luciferase, adicione 100 microliters de tampão de lise celular 1X aos poços.
Transfira a placa para um freezer negativo de 80 graus Celsius e incubar por pelo menos 30 minutos para garantir uma lise celular eficiente. Em seguida, coloque a placa contendo lise celular congelada em um banco para descongelar e prepare reagentes de substrato de luciferase de acordo com as recomendações do fabricante. Permita que os reagentes do substrato da luciferase se equilibrem à temperatura ambiente.
Em seguida, ligue o leitor de placas e abra o programa de leitor correspondente. Defina a máquina para medir a luminescência. Transfira 10 microliters de cada célula lysate para um poço de uma placa opaca de 96 poços.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters do reagente de ensaio de luciferase a cada poço da placa opaca. Bata suavemente a placa na lateral para misturar poços e certifique-se de que a superfície inferior esteja coberta com líquido. Coloque a placa em um leitor de placas e inicie a leitura.
Copie os valores de luminescência em um programa de planilha e plote os resultados. Este protocolo se concentra na ativação do fator de transcrição NF-kappa-B usando um repórter de luciferase dependente de NF-kappa-B que é stably transfectado em uma linha de células HeLa. Esta figura mostra um experimento representativo da ativação da luciferase dependente NF-kappa-B e da expressão genética IL6 em células HeLA 57A infectadas com as cepas de typhimurium salmonella.
A infecção com a cepa SL1344 tipo selvagem induziu um forte sinal de luciferase tanto na expressão RLU quanto no IL6, que foi diminuída em células infectadas com o sipA sopB sopE2 mutante triplo e reduzida aos níveis de controle com o sipA sopB sopE2 sopE mutante quádruplo. Preste muita atenção ao fazer suas diluições e revestimentos em série. Isso garantirá que você tenha um inóculo consistente em suas cepas.
Após identificar fatores que contribuem para a ativação da NF-kappa-B e mudanças a jusante na expressão do mRNA, a técnica de mancha ocidental pode ser usada para identificar mudanças na expressão proteica. Este protocolo permitiu que nosso laboratório não só avaliasse a ativação NF-kappa-B induzida por Salmonella, mas outros compostos e proteínas implicados na ativação de NF-kappa-B. Salmonella typhimurium é um patógeno humano.
Empregue EPI adequado ao trabalhar com essas bactérias.
