이 프로토콜은 NF-kappa-B 루시파 리포터를 표현하는 세포에서 NF-kappa-B 활성화의 변화를 결정하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 NF-kappa-B 활성화의 변화로 이어지는 요인 이나 조건의 높은 처리량 화면을 허용한다는 것입니다. NF-kappa-B는 다양한 세포 공정을 위한 전사 인자이다.
NF-kappa-B의 잘 알려진 기능은 다양한 사이토카인과 케모킨의 발현을 유도하여 염증 반응의 유도에 있다. 우리의 실험실은 병원체 살모넬라 타이피무륨에 의해 유도된 NF-kappa-B의 유도에 특히 관심이 있습니다. 여기서는 NF-kappa-B 루시프라아제 리포터 플라스미드와 안정적으로 전염되는 HeLa 세포주입니다.
다른 박테리아, 또는 심지어 바이러스 또는 화학 화합물, NF-kappa-B의 활성화를 연구 하기 위해이 세포주에서 사용할 수 있습니다. 다른 세포주도 이러한 NF-kappa-B 루시파라제 기자 플라스미드를 그 세포주에서 소개할 수 있는 경우에도 사용할 수 있다. 처음으로 이 일을 하는 누군가는 세포 배양 및 세균 작용에 필요한 멸균 기술을 제대로 활용하는 문제가 있을 수 있습니다.
세포 자극 의 하루 전에, 약 75%의 합류로 성장한 HeLa 57A 세포의 성장 매체를 제거합니다. 0.05%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터로 셀을 세척합니다. 또 다른 트립신 EDTA로 교체하고 플라스크를 섭씨 37도인큐베이터로 5분간 옮키십시오.
세포가 플라스크에서 분리 된 후, 성장 미디어의 10 밀리리터에서 그들을 중단. 셀 서스펜션 10마이크로리터와 Trypan 블루 10마이크로리터, 파이펫 위아래로 섞고 10마이크로리터를 셀 카운터 슬라이드로 옮겨 넣습니다. 세포 카운터를 이용하여 현탁액에서 세포를 카운트하고, 50 밀리리터 원모튜브에서 밀리리터당 5개의 세포에 2.5배 10배의 최종 농도로 세포를 희석시키기 위해 성장 매체를 사용한다.
세포 현탁액의 250 마이크로리터를 48웰 플레이트의 각 웰에 옮기. 주기적으로 상질세포 현탁액을 보장하기 위해 원물 튜브를 덮습니다. 측면에 있는 접시를 부드럽게 탭하여 세포가 우물에서 균일하게 분포되도록 합니다.
5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도로 옮기고 세포가 하룻밤 사이에 부착하고 성장할 수 있도록 합니다. 단일 식민지를 생산하기 위해 LB 한천 판에 살모넬라의 냉동 주식을 줄입니다. 플레이트를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터로 옮기고 하룻밤 동안 성장할 수 있습니다.
다음 날, 세균 배양 튜브를 멸균하기 위해 LB의 3 밀리리터를 추가하고 미디어에 적절한 항생제를 추가합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 줄무늬 세균 배양에서 단일 식민지를 선택하고 LB 미디어에 루프를 터치합니다. 튜브를 접종한 후 튜브를 캡핑하고 루프를 폐기합니다.
37섭씨와 180RPM으로 설정된 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 놓은 다음 박테리아가 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 합니다. 아침에, 인큐베이터에서 하룻밤 세균 문화를 검색합니다. 신선한 LB와 항생제의 3 밀리리터를 추가하여 서브컬쳐튜브를 준비합니다.
하룻밤 사이에 세균 배양30마이크로리터를 갓 제조된 배지로 옮기. 3시간 동안 섭씨 37도에 설정된 흔들리는 인큐베이터에 튜브를 놓습니다. 3 시간 인큐베이션 후, 멸균 LB 국물의 1 밀리리터를 플라스틱 큐벳으로 옮기면 빈 칸역할을 합니다.
샘플 분석에 사용할 다른 큐벳으로 LB의 900 마이크로리터를 전송합니다. 세균 서브컬쳐 100마이크로리터를 LB 900 마이크로리터를 함유한 큐벳으로 옮기고, 파이펫을 여러 번 위아래로 섞어 넣습니다. 각 세균 현탁액에 대해 이것을 반복하십시오.
분광계를 켜서 600 나노미터의 파장에서 세균 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 빈 칸을 분광광계에 놓습니다. 방향을 기록합니다.
뚜껑을 닫고 분광계의 빈 버튼을 눌러 배경 흡광도를 얻습니다. 빈 큐벳을 동일한 방향으로 샘플 큐벳으로 교체하고 읽기를 누릅니다. 이러한 샘플의 OD600 값을 기록합니다.
값을 10으로 곱하여 희석 계수를 고려합니다. 액수에서 1대 10까지 서스펜션을 희석하고 흡수도를 측정하며, 이는 밀리리터당 9CFU에 10회 10에 해당하는 약 0.1의 값을 제공해야 한다. 새로운 튜브에서, 희석 된 서브 컬쳐의 적절한 볼륨을 신선한 LB에 추가하여 밀리리터 당 8 CFU에 1회 10 의 현탁액을 달성하여 접종으로 사용된다.
밀리리터당 약 100CFU의 최종 희석이 이루어질 때까지 멸균 PBS의 450 마이크로리터를 포함하는 튜브로 세균 현탁액 50 마이크로리터를 전송하여 접종의 직렬 희석을 준비합니다. 밀리리터당 100및 1000 CFU의 100마이크로리터를 밀리리터당 100및 1000 CFU를 2개의 LB 한천 판으로 옮기고, 단일 콜로니를 얻기 위해 세포 스프레더로 서스펜션을 확산시한다. 이 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, 식민지를 계산하고 실제 접종 농도를 결정하기 위해 초기 접종의 세균 농도를 계산합니다. 같은 날에, 각 우물에 대해 사용될 감염 조건에 따라 플레이트의 뚜껑을 라벨, 각 조건은 triplicate에서 수행되는. 접종소 10마이크로리터를 적절한 우물에 추가하고 감염되지 않은 제어 우물에 멸균 LB 10 마이크로리터를 추가합니다.
감염 시간을 동기화하려면 플레이트를 탁상 원심분리기에 놓고 5분 동안 500회 G로 회전하여 플레이트의 균형을 맞췄습니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 이송합니다. 다음 단계에서 사용하기 위해 세포 배양 매체의 알리쿼트가 들어있는 15 밀리리터 원컬 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다.
감염 후 1시간 후, 수조에서 세포 배양 배지를 함유한 15밀리리터 원뿔관을 제거하고 70%에탄올로 외부를 닦아냅니다. 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 조직 배양 판을 옮길 수 있습니다. 멸균 팁을 사용하여 우물에서 미디어를 흡인하고 신선하고 따뜻한 세포 배양 매체의 250 마이크로 리터로 대체하십시오.
플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 4시간 더 되돌려 보냅니다. 그 후, 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 미디어를 흡인. 루시파아제 분석을 위해 1X 셀 리시스 버퍼의 100마이크로리터를 우물에 추가합니다.
플레이트를 음의 섭씨 80도로 옮기고 효율적인 세포 용액을 보장하기 위해 적어도 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 냉동 셀 리세이트가 들어 있는 플레이트를 벤치에 놓고 제조업체 권장 사항에 따라 루시파라기 기질 시약을 준비한다. 루시파라제 기질 시약이 실온에 평형화되도록 허용합니다.
다음으로 플레이트 판독기를 켜고 해당 판독기 프로그램을 엽니다. 발광을 측정하도록 기계를 설정합니다. 불투명 한 96 웰 플레이트의 우물에 각 셀 용액의 10 마이크로 리터를 전송합니다.
멀티채널 파이펫을 사용하여 불투명 플레이트의 각 웰에 루시파라래아세 분석 시약 50마이크로리터를 추가합니다. 측면에 있는 접시를 부드럽게 탭하여 우물을 섞고 바닥 표면이 액체로 덮여 있는지 확인합니다. 접시 를 접시 리더에 놓고 읽기를 시작합니다.
발광 값을 스프레드시트 프로그램에 복사하고 결과를 플롯합니다. 이 프로토콜은 안정적으로 HeLa 세포의 선으로 전염되는 NF-kappa-B 의존 루시파 리포터를 사용하여 전사 인자 NF-kappa-B의 활성화에 초점을 맞추고 있습니다. 이 수치는 살모넬라 타이피무륨 균주에 감염된 HeLA 57A 세포에서 NF-kappa-B 의존루시파-B 의존루시파 활성화 및 IL6 유전자 발현의 대표적인 실험을 나타낸다.
야생형 SL1344 균주를 통한 감염은 RLU 및 IL6 발현 모두에서 강력한 루시파래아제 신호를 유도하여 sipA sopB sopE2 삼중 돌연변이체에 감염된 세포에서 감소하고 sipA sopB sopE2 sopE2 sopE2 sopE 사중 돌연변이를 사용하여 대조 수준으로 감소하였다. 직렬 희석및 도금을 할 때주의를 기울이십시오. 이렇게 하면 균주 전체에 일관된 비수뇨가 있을 수 있습니다.
MRNA 발현의 NF-kappa-B 활성화 및 다운스트림 변화에 기여하는 요인을 확인한 후, 서양 블롯 기술을 사용하여 단백질 발현의 변화를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 우리의 실험실이 살모넬라에 의해 유도된 NF-kappa-B 활성화를 평가하는 것을 허용했습니다 그러나 NF-kappa-B 활성화에 연루된 그밖 화합물 및 단백질. 살모넬라 티피무륨은 인간 병원체입니다.
이러한 박테리아와 함께 작업 할 때 적절 한 PPE를 사용 하 고 있습니다.
