Desenvolvemos um método fácil para testar amostras de alimentos para os diferentes toxinotipos de c perfringens. Estamos particularmente interessados na prevalência de toxinotipos B e D que produzem a toxina epsilon. Nosso protocolo permite fácil enriquecimento e detecção dos vários toxinotipos c perfringens sem o uso de câmaras anaeróbicas ou incubadoras com subcultura limitada.
Este método também poderia ser usado para testar solo, água, amostras fecais e muito mais. Demonstrando o procedimento estarão Zuha Anwar e Samantha Regan, técnicos do laboratório. Comece preparando perfringens rápidos modificados médio, ou RPM.
Misture os ingredientes de acordo com as instruções do manuscrito e autoclave a mistura a 121 graus Celsius por 15 minutos. Deixe o meio esfriar a aproximadamente 40 graus Celsius, em seguida, adicione D-cicloserina a uma concentração final de 440 miligramas por litro. Transferir aseticamente o RPM para tubos cônicos de 15 mililitros, e armazenar a quatro graus Celsius por até um mês.
Antes de usar, aqueça o médio a 37 graus Celsius. Ao coletar amostras a serem testadas, transfira o alimento para o laboratório de acordo com as instruções do manuscrito. Se não for testado imediatamente, o alimento pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius.
Anote o tipo de alimento e o país de origem, bem como quaisquer outras informações relevantes. Para testar o alimento, transfira aproximadamente de um a dois gramas para uma placa de Petri estéril, e pique-a finamente com uma lâmina de barbear estéril ou bisturi. Inocular-o em 10 mililitros de PBS em um tubo cônico de 15 mililitros, e misture bem.
Selecione para células vegetativas transferindo cinco mililitros da mistura de alimentos PBS para um tubo cônico de 15 mililitros com 10 mililitros de RPM e fechando a tampa firmemente. Selecione para esporos aquecendo os cinco mililitros restantes da mistura a 85 graus Celsius por 15 minutos. E, em seguida, transferi-lo para um tubo com RPM e fechar a tampa firmemente.
Para garantir a mistura completa, vórtice e inverter as culturas de RPM alimentar. Em seguida, sele firmemente os tubos cônicos e enrole as tampas com filme de parafina para criar um ambiente anaeróbico. Incubar os tubos durante a noite a 37 graus Celsius e notar qualquer turbidez ou fermentação na manhã seguinte.
Prepare Tryptose Sulfite Cycloserine ou TSC Agar de acordo com a direção do fabricante e, em seguida, use a técnica do sanduíche para inocula-lo com culturas de RPM durante a noite. Prepare a camada base das placas transferindo 10 mililitros do Ágar derretido para placas de Petrie estéreis e permitindo que ela solidifique. Mantenha o TSC Agar restante a 40 graus Celsius para a camada superior, e transfira cuidadosamente 100 microliters da cultura RPM durante a noite para a base de Ágar.
Algumas culturas podem estar sob pressão devido à fermentação, por isso não deixe de usar todos os equipamentos de proteção individual apropriados. Espalhe a inoculina com contas de vidro estéreis ou um espalhador de células, e permita que o RPM seja absorvido no Ágar por cinco a 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta sorológica para transferir cuidadosamente 20 mililitros do TSC Agar derretido para a placa.
Substitua a tampa da placa de Petrie e permita que o TSC Agar solidifique completamente à temperatura ambiente, depois inverta a placa e incuba-a a 37 graus Celsius durante a noite. Se necessário, realize diluições seriais da cultura RPM antes da inoculação no TSC Agar. Após a incubação, examine as placas para o crescimento bacteriano.
Bactérias aeróbicas podem estar presentes na superfície do Ágar, enquanto bactérias anaeróbicas serão incorporadas no Ágar. As bactérias redutoras de Sulfite tornarão o ágar ao redor preto, e possíveis colônias de c perfringens serão negras e incorporadas no Ágar. Se houver uma densa quantidade de crescimento bacteriano aeróbico na superfície da placa, use um raspador de células para remover colônias de áreas selecionadas.
Use um conta-gotas de uso único estéril para arrancar as colônias suspeitas de C perfringens do Ágar, certificando-se de expulsar o ar antes de perfurar o Ágar. Transfira as colônias para 10 mililitros de RPM fresco em um tubo cônico de 15 mililitros. Várias colônias poderiam ser amostradas da mesma placa em culturas RPM separadas.
Segure firmemente as tampas cônicas do tubo, enrole-as em filme de parafina e incuba-as durante a noite a 37 graus Celsius. C perfringens é um organismo BSL dois. É importante usar as precauções de segurança adequadas em todos os momentos, especialmente ao abrir culturas de RPM durante a noite e descontaminar cuidadosamente e descartar os meios usados.
No dia seguinte, remova as culturas da noite para o dia e examine-as para turbidez e fermentação, em seguida, proceder com extração de DNA. Inverta suavemente a cultura RPM para dispersar qualquer bactéria assentada e abrir cuidadosamente o tubo. Transfira um mililitro para um tubo de microcentrífuga e pelota as bactérias por centrifugação.
Lave a pelota com um mililitro de PBS estéril. Se a gelatina não digerida se estabeleceu em cima das bactérias, fluff-lo agitando-se com PBS. Aspire suavemente a gelatina e a PBS e suspenda a pelota bacteriana restante com um mililitro de PBS fresco.
É importante remover qualquer gelatina pelleted com perturbação limitada da pelota celular. A não remoção da gelatina pode inibir a extração de DNA e a PCR. Centrifugar as bactérias por 10 minutos e aspirar cuidadosamente o supernante.
Em seguida, realize a extração de DNA usando um kit especificamente projetado para bactérias gram positivas. Use o DNA imediatamente ou armazene-o a menos 20 graus Celsius. Realize pcr no DNA extraído para determinar se as culturas são positivas para toxinotipos de c perfringens.
Use o DNA de perfringens C como um controle positivo para garantir que todos os reagentes PCR estejam funcionando. Execute o PCR de acordo com as instruções do manuscrito e analise os produtos com eletroforese de gel agarose. Este protocolo foi usado para testar um total de 216 amostras de alimentos compradas em lojas de varejo de Nova York.
As amostras incluíram várias amostras de carne, amostras de aves e amostras de frutos do mar. C perfringens Tipo B foi utilizado como um controle positivo. Verificou-se que 15 a 20% dos alimentos amostrados testam positivo para c perfringens.
Das 34 amostras positivas, 31 amostras continham a toxina alfa, uma amostra continha a toxina alfa, beta e epsilon. E duas amostras continham a toxina alfa e epsilon. Desenvolvemos um método fácil para testar amostras de alimentos para os diferentes toxinotipos de c perfringens.
Estamos particularmente interessados na prevalência de toxinotipos B e D que produzem a toxina epsilon.
