我々は、異なるCペルチエンストキシノタイプの食品サンプルをテストする簡単な方法を開発しました。我々は、イプシロン毒素を産生する毒素タイプBおよびDの有病率に特に関心を持っている。当社のプロトコルは、限られたサブ培養で嫌気性チャンバーまたはインキュベーターを使用することなく、さまざまなCペルフリン酸の容易な濃縮と検出を可能にします。
この方法は、土壌、水、便サンプルなどを試験するためにも使用できます。手順のデモンストレーションは、ラボの技術者であるズハ・アンワルとサマンサ・リーガンです。まず、変更された急速な侵害媒体、またはRPMを準備します。
原稿の指示に従って材料を組み合わせ、15分間摂氏121度で混合物をオートクレーブします。培地を約40°Cに冷却し、D-cycloserineを1リットル当たり440ミリグラムの最終濃度に加えます。無菌で15ミリリットルの円錐管にRPMを移し、摂氏4度で最大1ヶ月間貯蔵する。
使用する前に、37°Cに媒体を温めます。試験するサンプルを採取する際は、原稿の指示に従って食品を実験室に移す。すぐにテストしない場合、食品はマイナス20度で保存することができます。
食品の種類や原産国、その他の関連情報をメモします。食品をテストするには、滅菌ペトリ皿に約1〜2グラムを転送し、滅菌カミソリの刃またはメスで細かくミンチします。15ミリリットル円錐形チューブでPBSの10ミリリットルにそれを接種し、よく混ぜます。
PBS食品混合物の5ミリリットルを10ミリリットルのRPMで15ミリリットルの円錐管に移し、蓋をしっかりと閉じることで、栄養細胞を選択します。残りの5ミリリットルを摂氏85度に15分間加熱して胞子を選ぶ。そして、RPMでチューブに転送し、しっかりと蓋を閉じます。
完全な混合を確実にするために、ボルテックスと食品RPM培養を反転させる。次に円錐管を密封し、パラフィンフィルムで蓋を包み、嫌気性環境を作り出します。チューブを摂氏37度で一晩インキュベートし、翌朝に濁りや発酵に注意してください。
メーカーの指示に従ってトリプトーゼ亜硫酸シクロセリンまたはTSC寒天を準備し、サンドイッチ技術を使用して一晩のRPM培養物で接種します。溶融した寒天の10ミリリットルを無菌ペトリー皿に移し、固化させることでプレートのベース層を準備します。最上層の40°Cで残りのTSC寒天を維持し、慎重に寒天ベースに一晩のRPM培養の100マイクロリットルを転送します。
発酵による圧力を受ける培養物もあるので、適切な個人用保護具を全て着用してください。滅菌ガラスビーズまたは細胞スプレッダーでイノキュリンを広げ、RPMを寒天に5〜10分間吸収させます。次に、血清ピペットを使用して、溶融TSC寒天の20ミリリットルをプレートに慎重に移す。
ペトリー皿の蓋を交換し、TSC寒天が室温で完全に固まり、皿を反転させ、一晩摂氏37度でインキュベートできるようにします。必要に応じて、TSC寒天への接種前にRPM培養液の逐次希釈を行う。インキュベーション後、細菌の成長のためのプレートを調べます。
好気性細菌は寒天の表面に存在し、嫌気性細菌は寒天に埋め込まれる。亜硫酸還元細菌は周囲の寒天を黒くし、可能なCペルフリンジコロニーは黒色になり、寒天に埋め込まれます。プレートの表面に有酸素細菌の増殖が多い場合は、細胞スクレーパーを使用して、選択した領域からコロニーを除去します。
無菌の使い捨て用スポイトを使用して、寒天から疑わしいCペルフリンジコロニーを摘み取り、寒天を突き刺す前に空気を排出してください。15ミリリットル円錐形チューブで新鮮なRPMの10ミリリットルにコロニーを移します。複数のコロニーを同じプレートから別々のRPM培養物にサンプリングすることができた。
円錐形のチューブ蓋をしっかりと固定し、パラフィンフィルムで包み、摂氏37度で一晩インキュベートします。Cペルフリンは、BSL2個の生物である。特に夜間のRPM培養を開く際には、常に適切な安全対策を講じ、使用済み培地を慎重に除染・廃棄することが重要です。
翌日、一晩培養物を取り除き、濁りや発酵がないか調べ、次にDNA抽出を進める。RPM培養液を穏やかに反転させ、落ち着いた細菌を分散させ、チューブを慎重に開けます。1ミリリットルをマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離によって細菌をペレットにします。
ペレットを1ミリリットルの無菌PBSで洗います。未消化のゼラチンが細菌の上に落ち着いた場合は、PBSで攪拌することによってそれをふくらまします。ゼラチンとPBSを軽く吸引し、残りの細菌ペレットを1ミリリットルの新鮮なPBSで再懸濁します。
細胞ペレットの乱れが限られているペレット化ゼラチンを除去することが重要です。ゼラチンを除去しないと、DNA抽出やPCRを阻害する可能性があります。10分間細菌を遠心分離し、上清を慎重に吸引する。
次に、グラム陽性菌用に特別に設計されたキットを用いてDNA抽出を行う。DNAをすぐに使用するか、マイナス20度で保存してください。抽出したDNAにPCRを行い、培養物がCペルフリントキシノタイプに陽性であるかどうかを判断します。
CペルフリンDNAを正のコントロールとして使用して、すべてのPCR試薬が機能していることを確認します。原稿の方向に従ってPCRを実行し、アガロースゲル電気泳動で製品を分析します。このプロトコルは、ニューヨークの小売店から購入した合計216の食品サンプルをテストするために使用されました。
サンプルには、様々な肉サンプル、家禽サンプル、シーフードサンプルが含まれていました。CペルフリンB型は陽性対照として用いた。サンプル食品の15〜20%がCペルチエンスに陽性反応を示すことがわかった。
34個の陽性サンプルのうち、31サンプルにアルファ毒素が含まれ、1つのサンプルにはアルファ、ベータ、イプシロン毒素が含まれていた。そして、2つのサンプルにはアルファとイプシロン毒素が含まれていました。我々は、異なるCペルチエンストキシノタイプの食品サンプルをテストする簡単な方法を開発しました。
我々は、イプシロン毒素を産生する毒素タイプBおよびDの有病率に特に関心を持っている。
