Name: development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.
Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, fechados sapatos).
1. fabricação e caracterização de modificado eletrodo usando PLA-AuNPs
<ol><li>
Preparação e caracterização de PLA-AuNPs
	<ol>
<li>Rapidamente, adicionar 10 mL de solução de citrato de sódio (38,8 mM) para 100 mL de solução de Ácido cloroáurico aquosa (1 mM) a ferver e esfriar até a temperatura ambiente. Observe as alterações na cor da solução de AuNPs preparado, que começa como amarelo, alterações enegrecido e finalmente termina como vermelho rubi escuro.</li>
		<li>Coloque as bolinhas PLA em um molde de aço inoxidável para o processo de fusão e pré-aqueça-os a uma temperatura de 190 ° C por 10 min. siga com o procedimento de prensagem: colocá-los sob uma pressão de 2,2 MPa para 1 min como parte da preparação de folha PLA. A folha PLA estará pronta para uso após arrefecimento para cerca de 3 h.</li>
		<li>Mexendo vigorosamente, dissolva 0,68 mg das folhas de PLA em 5 mL de clorofórmio à temperatura ambiente. Misture o PLA dissolvido com 10 mL da solução de AuNPs previamente preparada e homogênea, misture-o à temperatura ambiente. As misturas homogéneas podem então ser denotadas como PLA-AuNPs e caracteriza-se usando o UV-Vis, XRD, temperatura e FESEM com EDX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação e caracterização de eletrodos modificados carbono serigrafado Nota: A SPCE utilizado neste estudo é composto por um sistema do três-elétrodo: um contador elétrodo, um carbono trabalho e um eletrodo de referência Ag/AgCl.<ol>
<li>Rapidamente, Pipetar 25 µ l da solução homogênea de PLA-AuNPs para a SPCE e, em seguida, ar secá-la por 24 h antes da utilização.</li>
		<li>Eletroquimicamente caracterizam os eletrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, em cianeto de potássio ferro (K3[Fe(CN)6]-3/4 -) para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. desenvolvimento do Biosensor eletroquímico DNA
<ol><li>
Preparação de sonda Nota: As sequências do DNA complementar e ssDNA sonda foram escolhidas com base na informação do centro nacional para o banco de dados Biotechnology Information (NCBI).<ol>
<li>Compra oligonucleotides sintéticos (20-mer ssDNA sonda, DNA complementar mer-20, 20-mer incompatível DNA e DNA não-complementar 21-mer) como pó liofilizado de laboratórios comerciais, com base na seguintes sequências: thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 ' DNA complementar: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - um-base DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - três bases DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - DNA não-complementar: 3 ' 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -</li>
		<li>Prepare as soluções de todos os oligonucleotides (100 µM) usando uma solução estéril e TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), dividida em parcelas analíticas. Manter a-4 ° C e então fazer as diluições apropriadas apenas antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Otimização de imobilização e hibridação Nota: Um SPCE modificado com PLA-AuNPs, denotado como SPCE/PLA-AuNPs, foi usado para este estudo e um método de fundição gota foi usado para a imobilização de DNA e a hibridação.<ol>
<li>Primeiro, imobilizar 25 µ l de thiolated ssDNA sonda sobre a SPCE/PLA-AuNPs e então ar secar por 24 horas à temperatura ambiente, depois que ele vai ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar a otimização da condição imobilização por meio de três fatores: a concentração do ssDNA (variando de 0,2 a 1,4 µM), tempo (variando de 30 a 210 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Pipete 25 µ l do DNA complementar sobre a superfície da SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para realizar o evento de hibridação, após o qual pode ser finalmente denotada como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determine a otimização da condição da hibridação através de dois fatores de tempo (variando de 5 a 30 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).</li>
		<li>Mergulhe o imobilizado e eletrodos hibridizados em 20 µM MB por 30 min. remover o DNA não-especificamente adsorvido e excesso MB por lavagem com 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada. Medida da corrente de pico de redução MB usando a técnica DPV. Executar a medição de DPV usando PBS 0,1 M (pH 7) não contendo nenhum indicador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Caracterização do biosensor DNA fabricado
	<ol>
<li>Mergulhe a SPCE/PLA-AuNPs em µM de 20 MB por 30 min, lavar com 0,5 M de ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada antes da medição. Segui um procedimento semelhante para todas as interações, incluindo a sonda DNA, DNA complementar, DNA incompatível e amostras de DNA não-complementares.</li>
		<li>Medir a redução eletroquímica. Nota: Nós medimos DPV usando um Autolab comercialmente fabricado com software de interface. As medições de DPV da redução eletroquímica MB realizada em um potencial que varia de -0,5 V a 0,25 V, com um potencial de passo de 0.005 V, amplitude de modulação de 0,05 V e uma taxa de varredura de 7,73 mVs-1 em PBS 0,1 M (pH 7), não contendo nenhum indicador. A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade térmica do biosensor DNA fabricado foram mais estudados. Resultados relatados foram apresentados como média de valor de medições em três repetições.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. validação do Biosensor DNA fabricado usando amostras reais
<ol><li>Preparação de cepas bacterianas
	<ol>
<li>Selecione amostras bacterianas baseadas sua contaminação significativa de frutos do mar31,32 . Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referência e 8 outras estirpes bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, enterite de Salmonella, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse Vibrio alginolyticus) da origem alimentar comum patógeno foram empregados para a validação de biosensor eletroquímica do DNA neste estudo.</li>
		<li>Realizar uma rotina sub-cultura de estirpes bacterianas em seu respectivo agar quinzenalmente para manter a sua viabilidade, consulte a tabela 1 para condições de cultura.</li>
		<li>Manter a preservação a longo prazo das cepas bacterianas em seus respectivos caldos crescentes contendo 20% (v/v) glicerol a-80 ° C, como glicerol protege bactérias, impedindo a formação de cristais de gelo que podem danificá-los durante o processo de congelamento. Em seguida, inocule um loop da cultura de pilha bacteriana conservados em estoque de glicerol para os respectivos caldos. Incube os caldos de acordo com seu respectivo crescimento tempo e temperatura, quando precisar de reviver as bactérias.</li>
		<li>Determine a quantidade de V. parahaemolyticus células usando uma placa de expansão técnica33, um padrão e um método conhecido para enumerar derivados de uma série de diluições de microorganismos.<ol>
<li>Cultura V. parahaemolyticus trypcase soja caldo (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C, num estado de agitação 140-rpm. Em seguida, transferir 1 mL de cultura de células de bactérias para 9ml de TSB + 3% NaCl para obter um fator de diluição 10-1 .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita essa etapa nove vezes para obter uma série completa de factor de diluição até 10-10 . Em seguida, espalhe 0,1 mL de cada fator de diluição (a partir de 10-1 a 10-10) na placa de ágar seletivo do Vibrio uma colônia contando, respectivamente. Incube as placas incubadas a 37 ° C por 24 h.</li>
		<li>Use um contador de colônia para contagem das colónias individuais e depois volta-calcular (contagem a quantidade CFU/pipetado x fator de diluição) para obter uma unidade formadoras de colônia por mililitro densidade (CFU mL-1). Derive a concentração da colônia formando unidades (CFUs) nas suspensões celulares de bactérias do terreno de calibração do UFC mL-1 contra absorvância.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do ensaio do PCR
	<ol>
<li>Extrair DNA genômico seguindo uma modificada fervido lise procedimento34. Primeira, raia uma bacterianas individuais Coe em meios de ágar e inoculá-lo na mídia de caldo, seguida por incubando-lo em sua condição de crescimento relativo, um 140 rpm tremendo condição.</li>
		<li>Pipete uma cultura de 1 mL de caldo de carne para um tubo de centrífuga de micro. Centrifugar-isto a 4830 x g e 4 ° C, durante 1 min obter Pelotas. Use cerca de 500 µ l de tampão estéril de TE para re-suspensão com a pelota. Segure a suspensão resultante durante 10 minutos no 98 ± 2 ° C em um bloco de aquecimento e chill-lo imediatamente a-18 ° C por 10 min lisar as células e liberar o DNA.</li>
		<li>Centrifugar o DNA genômico a 4830 x g e 4 ° C por 3 min obter uma suspensão clara e manter o sobrenadante a-20 ° C para utilização posterior. Use uma medida de biophotometer com absorção de UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as proteínas de absorção de luz de comprimento de onda) para determinar a concentração e pureza do extraído DNA genômico e então identificar todas as estirpes utilizando ensaios bioquímicos padrão35 e verificá-los por 16S rRNA gene sequenciamento36. Finalmente, desnaturar o DNA genômico a 92 ° C por 2 min e resfriá-lo rapidamente em água gelada antes da aplicação para o biosensor.</li>
		<li>Confirmar a presença de V. parahaemolyticus usando PCR para o gene toxR-alvo. Execute esse procedimento em um thermocycler usando um par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Otimize a amplificação por PCR em um volume total de reação de 25 μL, consistindo de água esterilizada (15,5 µ l), tampão (5 µ l), primeira demão (1 µ l, 10 µM), dNTP mix (1 µ l), modelo de DNA (2 µ l) e Taq DNA polimerase (0,2 µ l, 10x).</li>
		<li>Misture os componentes bem e organizar a amplificação por PCR da sequência de destino em um thermocycler programado para 30 ciclos de amplificação. Em nosso estudo, cada ciclo consistiu em três etapas de reações , ou seja,., desnaturação inicial (94 ° C, 3 min), seguido de 30 ciclos de desnaturação (94 ° C, 1 min), recozimento (63 ° C, 1,5 min) e extensão (72 ° C, 1,5 min), seguido pela extensão final (72 ° C, 7 min).</li>
		<li>Determine os produtos amplificados e seus tamanhos através de electroforese em gel de agarose 1,5%. Capture as imagens de gel com um sistema de gel-documentação produzidos comercialmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras de berbigão
	<ol>
<li>Obter amostras frescas. Nota: Nosso berbigão fresco (Anadara granosa) foram obtido a partir do mercado molhado em Serdang, Selangor e rapidamente trazido para o laboratório em uma caixa de gelo mais fresca para análise. Divida as amostras em 2 grupos, ou seja, o grupo tratado e não tratado, assumindo que o berbigão foram colhida uniformemente desde o início da safra até colocá-los em armazenamento frio.</li>
		<li>Pré-tratamento berbigão no grupo tratado, armazenando-os em-20 ° C por 24 h, seguido de exposição à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA. Nota: A temperatura de congelamento e exposição aos raios UV, usado para a controlada grupo mata ou pelo menos limita a naturalmente acumular V. parahaemolyticus nas amêijoas. Não aplica um regime mais elevado de pasteurização de 70 ° C como o objetivo da condição controlada neste estudo é imitar a situação real das amêijoas frescas. Entretanto, analise amostras diretamente do grupo não tratado sem qualquer tratamento prévio, assim que eles chegam no laboratório.</li>
		<li>Subcultura de uma estirpe de V. parahaemolyticus ATCC 17802 em TSB (3% NaCl). Determinar o nível de células viáveis em inóculo através de chapeamento de diluições apropriadas de TSB (3% NaCl) na CA a fim de obter um inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berbigão em água destilada e esfrega-lo livre de sujeira antes de usar a pinça estéril em um fluxo laminar para remover os tecidos da casca.</li>
		<li>Homogeneizar a cerca de 10 g de amostras de tecido de berbigão com um homogeneizador em 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) por 60 s. adicionar uma quantidade conhecida de V. parahaemolyticus para 9 mL do caldo para as amostras cravados de amostra homogeneizada. Use as amostras bilirrrubina como controlo negativo. Estimar a contagem de células de V. parahaemolyticus cravado para as amostras de berbigão por chapeamento 0,1 mL das amostras na CA, e posteriormente, Pipetar 1 mL de amostras em um tubo de microcentrifugadora de DNA da amostra extração, para ser usado na biosensor e ensaio PCR.</li>
		<li>Extrai o DNA genômico do V. parahaemolyticus das amostras cravadas e bilirrrubina seguindo um modificado de fervido lise procedimento36. Finalmente, determinar a concentração de DNA e pureza, usando uma medição do Fotômetro de bio com absorção UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as comprimento de onda de absorção de proteínas).</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.
Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de...

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.
V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.
Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

<table><tbody><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Disodium hydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate III</td><td>R&amp;amp;M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate anhydrous salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix with Dual-Dye</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin methylene blue agar&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Loading dye 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol egg yolk polymyxin agar</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an electrochemical dna biosensor to detect a foodborne pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

Formação de AuNPs foi revelada através da mudança na cor da solução aquosa com citrato de sódio presente. Isto causou a cor mudar de amarelo claro para um vermelho rubi profundo. A geração de PLA-AuNPs foi confirmada de espectros de UV-vis (Figura 1), onde o crescimento do pico de ressonância (SPR) do plasmon de superfície foi encontrado a cerca de 540 nm. A formação e a existência de PLA-AuNPs foi indicado em intervalos de comprimento de onda 5...

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Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K visualizações.  Universiti Putra Malaysia. Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Vídeo: Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Bioengenharia

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Imunologia e Infecção

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Biologia

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Plataforma de Microfluidos Digitais baseada em eletrowetting para ensaio imunosorbent automatizado ligado à enzima

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

Detecção Colorimétrico de bactérias usando teste decisivo

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...