Este protocolo permite ao pesquisador quantificar o desenvolvimento de ductos biliares em modelos de camundongos de doença hepática. Também permite avaliar os efeitos dos modificadores genéticos no desenvolvimento do ducto biliar. A vantagem dessa técnica é que é um método simples, sensível e quantitativo para a avaliação direta do desenvolvimento do ducto biliar.
Para começar, com a pele esticada por fórceps, use uma pequena tesoura para fazer uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica de um rato eutanizado. Exponha toda a superfície ventral do fígado. Use uma tesoura pequena para cortar cuidadosamente os ligamentos que ligam o fígado aos outros órgãos do abdômen.
Em seguida, corte o ducto biliar comum para separar o fígado do intestino. Segure-se na vesícula biliar e remova cuidadosamente o fígado. Coloque-o imediatamente em um tubo de 50 mililitros preenchido três quartos com 4% de paraformaldeído.
Para consertar o tecido hepático, incuba-o em 4% PFA a quatro graus Celsius por 48 horas. Depois de uma série de lavagem de etanol, lave o fígado com agente de compensação três vezes por 30 minutos cada um em temperatura ambiente. Para começar a incorporar, lave uma fita de tecido em um molde de tecido três vezes por 30 minutos em cera de parafina pré-superaquecida a 60 graus Celsius.
Em seguida, encha o molde de tecido com cera de parafina a três quartos de altura e mantenha-o em um bloco de aquecimento a 60 graus Celsius. Coloque o fígado no molde com o lado ventral voltado para cima. Depois de remover cuidadosamente o molde do bloco de aquecimento, coloque a parte superior do no molde.
Cubra com parafina líquida quente e deixe esfriar à temperatura ambiente durante a noite. Depois de remover o bloco hepático do molde, use um microtome para começar a se separar pelo lado dorsal superficial do fígado, fazendo cinco seções de micrômetros. Verifique as seções superficiais sob um microscópio de dissecção para garantir que as seções não sejam tesouradas ou dobradas.
Para processar slides para imunohistoquímica, selecione um slide por genótipo para ser analisado e lave-o por 15 minutos em xileno, 100% etanol, 95% etanol e, finalmente, 70% etanol. Depois de lavar o slide na água ionizada, mergulhe-o na solução de recuperação de antígeno de pH à base de Tris. Em seguida, aqueça-o sob pressão em uma panela de pressão por três minutos a 10 libras por polegada quadrada.
Depois de deixar o slide esfriar até a temperatura ambiente, use uma caneta PAP para delinear as seções no slide. Depois de lavar com PBS Tween, bloqueie as seções teciduais adicionando 100 microliters de solução de bloqueio por seção e incubar coberto a quatro graus Celsius por uma hora. Aplique 100 microlitadores da solução de anticorpos diluídos contendo todos os três anticorpos primários em cada seção e incuba-os a quatro graus Celsius durante a noite.
Após lavar as lâminas, adicione 100 microliters da solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Por último, aplique meio de montagem e uma mancha de cobertura nos slides. Use um microscópio fluorescente para tirar imagens de 20x a 1x de zoom de cada seção.
Certifique-se de que todas as veias do portal através do fígado são imagens. Crie uma planilha com as seguintes colunas:Número de animais/amostra, número da imagem, número de veias do portal e número de dutos biliares. Identifique e regise o número de veias do portal por imagem para cada imagem.
Em seguida, identifique os dutos biliares patenteados em cada imagem, pela presença de cholangiocitos em torno de um lúmen definível. Essas estruturas devem ser distintas e separadas por mesenquime de outras células citokeratinas de amplo espectro. Um dos principais desafios dessa técnica é identificar dutos biliares de patente.
Determinar o que é um duto de patente requer uma análise da forma do duto e das células ao redor do lúmen. Conte cada ducto bile de patente e coloque na mesma coluna do número da imagem e repita para cada imagem venosa do portal. Finalmente, calcule a soma de todas as veias do portal e todos os dutos biliares na amostra hepática e calcule a relação biliar do ducto ao portal para a amostra hepática.
Os fígados de camundongos P30 foram seccionados e co-manchados para CK8 e CK19, juntamente com o marcador vascular, alfa-SMA, para determinar a razão BD para PV. Quando todas as veias do portal em cada lobo hepático são imagens, as veias do portal foram definidas como vasos manchados alfa-SMA que têm manchas de citoquenatina de amplo espectro adjacentes. As estruturas de manchas alfa-SMA sem citoquestina de amplo espectro foram veias centrais que foram excluídas da análise.
Os dutos de patente têm um lúmen claramente definível que é cercado por colangioctyes citokeratin-positivo de amplo espectro e geralmente são separados de dutos próximos ou cholangiocitos por mesenchyme. Células de citokeratin-positivas de amplo espectro que não têm um lúmen definível, não são contadas para o número total de dutos biliares. A seção hepática de um animal selvagem mostra uma veia portal associada a um duto totalmente patenteado, juntamente com várias células não incorporadas.
A seção hepática representativa de um animal heterozigoso JAG1 não mostra que há dutos biliares patenteados ao redor das três veias do portal. Todas as células citokeratine-positivas de amplo espectro aqui não são incorporadas e, portanto, não devem ser contadas. A análise da relação BD para PV para três animais heterozigosos de tipo selvagem e três JAG1 mostra como os dois genótipos podem ser facilmente distinguidos com base na contagem de dutos biliares.
É importante avaliar todos os vasos portais para dutos biliares. É especialmente crítico para determinar a densidade do ducto biliar se houver variabilidade fenotípica em todo o fígado. Esta técnica foi usada para identificar um supressor genético do fenótipo biliar em um modelo de rato de Helgason.
Portanto, pode ser útil na avaliação de modalidades de tratamento de modelos animais de doença biliar.
