Este protocolo permite al investigador cuantificar el desarrollo de conductos biliares en modelos de ratón de enfermedad hepática. También permite evaluar los efectos de los modificadores genéticos en el desarrollo de conductos biliares. La ventaja de esta técnica es que es un método sencillo, sensible y cuantitativo para la evaluación directa del desarrollo de conductos biliares.
Para empezar, con la piel tensa por fórceps, utilice tijeras pequeñas para hacer una incisión transversal aproximadamente una pulgada por debajo de la caja torácica de un ratón eutanizado. Exponga toda la superficie ventral del hígado. Usa tijeras pequeñas para cortar cuidadosamente los ligamentos que conectan el hígado con los otros órganos del abdomen.
Luego, corta el conducto biliar común para separar el hígado del intestino. Agárrate a la vesícula biliar y retira cuidadosamente el hígado. Colóquelo inmediatamente en un tubo de 50 mililitros lleno de tres cuartos con 4%paraformaldehído.
Para fijar el tejido hepático, incubarlo en 4%PFA a cuatro grados Celsius durante 48 horas. Después de una serie de lavados de etanol, lave el hígado con agente limpiador tres veces durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente. Para comenzar a incrustar, lave un cassette de tejido en un molde de tejido tres veces durante 30 minutos en cera de parafina precalentada a 60 grados Centígrados.
Luego, llene el molde de tejido con cera de parafina a tres cuartos de altura y manténgalo en un bloque de calentamiento a 60 grados Centígrados. Coloque el hígado en el molde con el lado ventral hacia arriba. Después de retirar cuidadosamente el molde del bloque de calefacción, coloque la parte superior del cassette en el molde.
Rescinda con parafina líquida caliente y dé la calma a temperatura ambiente durante la noche. Después de retirar el bloqueo hepático del molde, utilice un microtoma para comenzar a seccionar a través del lado dorsal superficial del hígado, haciendo secciones de cinco micrómetros. Compruebe las secciones superficiales bajo un microscopio de disección para asegurarse de que las secciones no estén cortadas o dobladas.
Para procesar diapositivas para inmunohistoquímica, seleccione una diapositiva por genotipo que se analizará y lávela durante 15 minutos en xileno, 100% etanol, 95% etanol y, finalmente, 70% etanol. Después de lavar el tobogán en el agua ionizada, sumerja en la solución de recuperación de antígeno de alto pH basada en Tris. Luego, calienta bajo presión en una olla a presión durante tres minutos a 10 libras por pulgada cuadrada.
Después de dejar que la diapositiva se enfríe a temperatura ambiente, utilice un lápiz PAP para delinear las secciones de la diapositiva. Después de lavar con PBS Tween, bloquee las secciones de tejido añadiendo 100 microlitros de solución de bloqueo por sección e incubar cubierto a cuatro grados Centígrados durante una hora. Aplicar 100 microlitros de la solución de anticuerpos diluidos que contengan los tres anticuerpos primarios en cada sección e incubarlos a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de lavar los portaobjetos, añadir 100 microlitros de la solución secundaria de anticuerpos que contengan anticuerpos secundarios e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Por último, aplique el medio de montaje y un cubreobjetos a las diapositivas. Utilice un microscopio fluorescente para tomar imágenes de 20x con zoom 1x de cada sección.
Asegúrese de que todas las venas porta a través del hígado estén imágenes. Cree una hoja de cálculo con las siguientes columnas: Número de animal/muestra, número de imagen, número de venas porta y número de conductos biliares. Identifique y registre el número de venas porta por imagen para cada imagen.
A continuación, identificar los conductos biliares patentados en cada imagen, por la presencia de colangiocitos que rodean un lumen definible. Estas estructuras deben ser distintas y separadas por mesenquimo de otras células citoqueratina-positivas de amplio espectro. Uno de los principales desafíos de esta técnica es identificar los conductos biliares patentados.
Determinar qué es un conducto de patente requiere un análisis de la forma del conducto y las células que rodean el lumen. Cuente cada conducto biliar patentado y colóquelo en la misma columna que el número de imagen y repita para cada imagen de vena porta. Por último, calcule la suma de todas las venas porta y todos los conductos biliares en la muestra hepática y calcule la relación entre el conducto biliar y la vena porta para la muestra hepática.
Los hígados de ratón P30 fueron seccionados y co-manchados para CK8 y CK19 junto con el marcador vascular, alfa-SMA, para determinar la relación BD a PV. Cuando se visualizan todas las venas porta en cada lóbulo hepático, las venas porta se definieron como vasos manchados de alfa-SMA que tienen manchas adyacentes de citoqueracina de amplio espectro. Las estructuras de tinción alfa-SMA sin citoqueracina de amplio espectro eran venas centrales que fueron excluidas del análisis.
Los conductos de patente tienen un lumen claramente definible que está rodeado por colangioctyes citoqueratina-positivas de amplio espectro y generalmente están separados de los conductos cercanos o colangiocitos por mesenquima. Las células citoqueratina-positivas de amplio espectro que no tienen un lumen definible, no se cuentan para el número total de conductos biliares. La sección hepática de un animal de tipo salvaje muestra una vena porta asociada con un conducto completamente patentado junto con varias células no incorporadas.
La sección hepática representativa de un animal heterocigoto JAG1 muestra que no hay conductos biliares patentados alrededor de las tres venas porta. Todas las células citoqueratina-positivas de amplio espectro aquí no están incorporadas y, por lo tanto, no deben ser contadas. El análisis de la relación BD a PV para tres animales heterocigotos JAG1 y de tipo salvaje muestra cómo los dos genotipos se pueden distinguir fácilmente en función del recuento de conductos biliares.
Es importante evaluar todos los vasos del portal en busca de conductos biliares. Es especialmente crítico para determinar la densidad de los conductos biliares si hay variabilidad fenotípica en todo el hígado. Esta técnica se utilizó para identificar un supresor genético del fenotipo biliar en un modelo de ratón de Helgason.
Por lo tanto, puede ser útil en la evaluación de las modalidades de tratamiento de modelos animales de enfermedad biliar.
