O objetivo geral deste procedimento experimental é a geração de vírus zika recombinante infeccioso a partir de um clone de CDNA de comprimento completo, montado em um cromossomo artificial bacteriano sob o controle do citomegalovírus humano imediatamente promotor. O desenvolvimento de sistema genético reverso para vírus RNA como o zika vírus permite a manipulação direta do genoma do vírus para estudar múltiplos aspectos da biologia viral e patogênese e desenvolver estratégia de vacina. A principal vantagem dessa técnica é que a construção do vírus Zika clone infeccioso como cromossomo artificial bacteriano supera a toxicidade associada ao genoma do flavivírus e permite o resgate de vírus infecciosos por transfecção direta do clone bac cDNA em células suscetíveis.
Essa metodologia poderia ser aplicada à construção de clones cDNA infecciosos estáveis e totalmente funcionais para outros flavivírus, bem como outros vírus de RNA com fios positivos. Para iniciar esse procedimento, construa o clone cDNA do vírus Zika conforme descrito no protocolo de texto, utilizando locais de restrição apropriados. Quatro fragmentos de DNA que abrangem o genoma do vírus Zika ladeados pelo promotor do CMV humano na extremidade cinco-prime e o vírus da hepatite delta ribossomo e o término do hormônio do crescimento bovino e sequências de poliadenylation na extremidade três-prime são montados em um plasmídeo de cromossomo artificial bacteriano.
Primeiro, crie uma única colônia de E.coli DH10B carregando o clone infeccioso do vírus pBAC-Zika em cinco mililitros de meio LB contendo clorofílico por oito horas a 37 graus Celsius com tremor suave. Em seguida, adicione 500 mililitros do meio LB contendo clorofílito a um frasco de dois litros. Adicione um mililitro da cultura bacteriana preparada ao frasco e cresça as células a 37 graus Celsius por 14 a 16 horas até que o OD600 seja de aproximadamente 0,6 a 0,8.
Depois disso, use um kit comercial desenvolvido especificamente para purificação bac para purificar o clone de cDNA de infecção bac por lise alcalina seguindo as instruções do fabricante. Um dia antes da transfecção, as células de Vero de placa nos poços de uma placa de seis poços a uma densidade de 500.000 células por poço em meio de crescimento. Para preparar a mistura de transfecção, adicione quatro microgramas do clone BAC cDNA a 250 microliters de meio reduzido de soro e misture cuidadosamente.
Em um tubo separado, dilui 12 microliters de agente transfecção em 250 microliters de meio reduzido de soro. Vórtice para misturar e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, combine o BAC cDNA diluído com o agente de transfecção.
Misture cuidadosamente e incubar à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Durante este período de incubação, use meio de crescimento sem antibióticos para lavar as células Vero e deixar as células em um mililitro de meio fresco sem antibióticos. Em seguida, distribua os 500 microliters da mistura de reagentes de cDNA e transfecção nas células Vero dropwise.
Balance a placa para frente e para trás para misturar e incubar as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis horas. Depois disso, remova o meio de transfecção e adicione dois mililitros de meio de crescimento fresco com antibióticos. Incubar as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5%, certificando-se de verificar todos os dias a indução do efeito citopático.
Após quatro a seis dias de transfecção, quando o CPE está em torno de 50 a 75% recolhem os supernantes da cultura tecidual em tubos cônicos de 15 mililitros e centrífuga por 10 minutos para remover detritos celulares. Em seguida, colhe os supernacantes contendo o vírus Zika recombinante e descarte as pelotas celulares. Aliquot o supernatante em criotubos e armazená-los a menos 80 graus Celsius.
Para começar, cresça células Vero para 90% de confluência. Lave as células duas vezes com PBS e infecte-as com o vírus resgatado com a multiplicidade de infecção de 0,1 em meio de crescimento contendo 2% de FBS. Coloque as placas das células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e rocha a cada 15 minutos durante o período de adsorção de 90 minutos.
Após adsorção viral, remova o inóculo viral e adicione um meio de crescimento fresco com 2%FBS. Incubar três ou quatro dias nas mesmas condições utilizadas anteriormente. Quando o CPE é aproximadamente 75% coletar a cultura tecidual e centrífuga para remover detritos celulares.
Em seguida, colher o supernasce contendo zika vírus recombinante e descartar a pelota. Aliquot o supernatant em criotubos. Coloque os tubos em uma caixa de congelamento e armazene-os a menos 80 graus Celsius.
Quando estiver pronto, remova uma alíquota do vírus do congelador e determine o título viral por ensaio de placa conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, um clone de CDNA estável e completo da cepa do vírus Zika Rio Grande do Norte Natal é gerado pela clonagem sequencial de quatro fragmentos de CDNA sobrepostos no cromossomo artificial bacteriano pBeloBAC11 utilizando métodos convencionais de clonagem e locais de restrição únicos presentes no genoma viral. Este clone de CDNA foi flanqueado na extremidade cinco-prime pelo promotor do citomegalovírus humano para permitir a expressão de RNA viral no núcleo de células transfeinadas e na extremidade três-prime pelo vírus da hepatite delta ribossomo seguido pelo término do hormônio do crescimento bovino e sequência de poliadenylation para produzir RNAs contendo a extremidade três-prime exata do genoma viral.
Uma vez que o BAC cDNA é montado, o vírus infeccioso pode ser facilmente recuperado após a transfecção direta de células Vero suscetíveis com o clone bac cDNA usando lipossomos cônicos. Usando essa abordagem, o R Zika virus RGN pode ser resgatado com títulos superiores a um milhão de unidades formadoras de placas por mililitro. Além disso, o vírus resgatado induz um claro efeito citopático e gera placas homogêneas de cerca de dois milímetros de tamanho.
A identidade do vírus resgatado é confirmada através da análise de imunofluorescência usando um anticorpo monoclonal específico para a proteína Zika virus E. No geral, esses resultados demonstram que o vírus zika recombinante infeccioso pode ser resgatado de clones de CDNA em comprimento total montados em um BAC. Em resumo, desenvolvemos uma poderosa abordagem genética reversa do vírus Zika baseada no uso de um cromossomo artificial bacteriano que poderia ser adaptado para gerar infecções estáveis e funcionais com o clone de CDNA de outros vírus de RNA de fios positivos para facilitar o estudo da patologia, desenvolver uma vacina e ou facilitar a identificação de medicamentos com atividade antiviral.
