Bu deneysel prosedürün genel amacı, insan sitomegalovirüs hemen erken organizatörü kontrolü altında bir bakteri yapay kromozom monte tam uzunlukta cDNA klon, enfeksiyöz rekombinant Zika virüsü üretimidir. Zika virüsü gibi RNA virüsleri için ters genetik sistemin geliştirilmesi, virüs genomunun doğrudan manipülasyonunun viral biyoloji ve patogenezin birçok yönünü incelemesine ve aşı stratejisi geliştirmesine olanak sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bakteriyel yapay kromozom olarak Zika virüsü enfeksiyöz klonunun yapımının flavivirüs genomu ile ilişkili toksisitenin üstesinden gelmesi ve BAC cDNA klonu doğrudan duyarlı hücrelere transfeksiyonu ile enfeksiyöz virüsün kurtarılmasına olanak sağlamasıdır.
Bu metodoloji, diğer flavivirüslerin yanı sıra diğer pozitif iplikli RNA virüsleri için kararlı ve tam işlevli enfeksiyöz cDNA klonları oluşturmak için uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, uygun kısıtlama sitelerini kullanarak metin protokolünde belirtildiği gibi Zika virüs cDNA klonunu oluşturmak. Zika virüs genomunu kapsayan dört DNA parçası beş asal uçta insan CMV organizatörü tarafından kuşatılmış ve hepatit delta virüsü ribozom ve üç asal uçtaki büyükbaş büyüme hormonu sonlandırma ve poliadenilasyon dizileri bakteriyel yapay kromozom plazmidinde bir araya getirilmiştir.
İlk olarak, pBAC-Zika virüsü enfeksiyöz klonunu taşıyan tek bir E.coli DH10B kolonisini, yumuşak bir titreme ile 37 derecede sekiz saat boyunca kloramfenikol içeren lb ortamının beş mililitrelik kısmını taşıyın. Sonra, iki litrelik bir şişe kloramfenikol içeren LB orta 500 mililitre ekleyin. OD600 yaklaşık 0,6 ila 0,8 olana kadar şişeye hazırlanan bakteri kültürünün bir mililitre ekleyin ve 14 ila 16 saat boyunca 37 santigrat derecede hücreleri büyümek.
Bundan sonra, üreticinin talimatlarına uyarak, BAC enfeksiyonu cDNA klonunu alkali lysis ile arındırmak için BAC arınması için özel olarak geliştirilmiş ticari bir kit kullanın. Transfeksiyondan bir gün önce, Vero hücrelerini büyüme ortamının iyi bir yerinde 500, 000 hücrelik bir yoğunlukta altı kuyuluk tabakasının kuyularına kesin. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, 250 mikrolitre serum azaltılmış ortama dört mikrogram BAC cDNA klon unu ekleyin ve dikkatlice karıştırın.
Ayrı bir tüpte, 250 mikrolitre serum azaltılmış ortamda 12 mikrolitre transfeksiyon maddesi seyreltin. Girdap karıştırmak ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra seyreltilmiş BAC cDNA'yı transfeksiyon maddesi ile birleştirin.
Dikkatlice karıştırın ve 20-30 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bu kuluçka döneminde, Vero hücreleri yıkamak ve antibiyotik olmadan taze orta bir mililitre hücreleri bırakmak için antibiyotik olmadan büyüme ortamı kullanın. Daha sonra, cDNA ve transfeksiyon reaktif karışımının 500 mikrolitresini Vero hücrelerine damla cıktır dağıtın.
Altı saat boyunca %5 karbondioksitle 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde hücreleri karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için plakayı ileri geri sallayın. Bundan sonra, transfeksiyon orta kaldırmak ve antibiyotikler ile taze büyüme orta iki mililitre ekleyin. Hücreleri nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve sitopatik etkiyi indüksiyon için her gün kontrol edin.
Transfeksiyon dört ila altı gün sonra, CPE yaklaşık% 50-75 olduğunda 15 mililitrelik konik tüpler ve santrifüj hücreenkaz kaldırmak için 10 dakika doku kültürü supernatants toplamak. Sonra, rekombinant Zika virüsü içeren supernatants hasat ve hücre pelet atın. Aliquot kriyotüpler içinde supernatant ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın.
Başlamak için,% 90 birleştiğinde Vero hücreleri büyümek. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve %2 FBS içeren büyüme ortamında 0,1 enfeksiyon çokluğu ile kurtarılan virüs ile enfekte. 90 dakikalık adsorpsiyon süresi boyunca her 15 dakikada bir %5 karbondioksit ve kaya ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine hücre plakalarını yerleştirin.
Viral adsorpsiyon sonra, viral inoculum kaldırmak ve% 2 FBS ile taze büyüme ortamı ekleyin. Daha önce kullanılan aynı koşullarda üç veya dört gün kuluçka. CPE yaklaşık% 75 hücresel enkaz kaldırmak için doku kültürü supernatant ve santrifüj toplamak olduğunda.
Sonra, rekombinant Zika virüsü içeren supernatant hasat ve pelet atın. Aliquot supernatant kriyotubes içine. Tüpleri dondurucu bir kutuya yerleştirin ve eksi 80 derecede saklayın.
Hazır olduğunuzda, dondurucudan bir virüs aliquot çıkarın ve metin protokolünde belirtildiği gibi plak testi ile viral titreyi belirleyin. Bu çalışmada, Zika virüsü suş Rio Grande do Norte Natal istikrarlı, tam uzunlukta cDNA klonu sırayla bakteriyel yapay kromozom pBeloBAC11 içine geleneksel klonlama yöntemleri ve viral genom mevcut benzersiz kısıtlama siteleri kullanılarak dört örtüşen cDNA parçaları klonlama tarafından oluşturulur. Bu tam uzunlukta ki cDNA klonu insan sitomegalovirüs organizatörü tarafından beş asal uçta, transfected hücrelerin çekirdeğinde viral RNA'nın ekspresyonuna izin vermek için ve hepatit delta virüs ribozomunun ardından üç asal uçta, viral genomun tam üç asal ucunu içeren RNA'lar üretmek için büyükbaş büyüme hormonu sonlandırılması ve poliadenilasyon dizisi ile kuşatıldı.
BAC cDNA biraraya getirildiğinde, katyonik lipozomlar kullanılarak duyarlı Vero hücrelerinin BAC cDNA klonu ile doğrudan transfeksiyonundan sonra enfeksiyöz virüs kolayca bulunabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, R Zika virüsü RGN mililitre başına bir milyon plak oluşturan birimlerin üzerinde titreile kurtarılabilir. Buna ek olarak, kurtarılan virüs net bir sitopatik etki yaratır ve boyutu yaklaşık iki milimetre homojen plaklar üretir.
Kurtarılan virüs kimliği, Zika virüsü E proteini için spesifik bir monoklonal antikor kullanılarak immünfloresans analizi ile doğrulanır. Genel olarak, bu sonuçlar bulaşıcı rekombinant Zika virüsünün bir BAC'da biraraya getirilen tam uzunluktaki cDNA klonlarından kurtarılabildiği gösterilmiştir. Özetle, patolojinin incelenmesini kolaylaştırmak, aşı geliştirmek ve antiviral aktivite ile ilacın tanımlanmasını kolaylaştırmak için diğer pozitif iplikli RNA virüslerinin cDNA klonu ile stabil ve fonksiyonel enfeksiyonlar oluşturmak için uyarlanabilen bakteriyel yapay kromozom kullanımına dayalı güçlü bir Zika virüsü ters genetik yaklaşım geliştirdik.
