Lyssavirus é um zoológico-não-tic patógenos. Para avaliar a presença de Lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciamos um programa de vigilância. E identificou com sucesso quatro Lyssaviruses de 2016 a 2018.
Este protocolo é uma introdução passo-a-passo para a vigilância vi-al Lyssavirus em Taiwan. Esperamos que seja útil para pesquisas interessadas na vigilância vi-al Lyssavirus. É importante conectar o símbolo tac-barril correto.
Um morcego morto ou moribundo é mais adequado do que um morcego vivo para vigilância do Lyssavirus. Dependendo das normas de biosegurança do país onde está localizado o laboratório; realize os seguintes procedimentos em um laboratório adequado de nível de bio-segurança. E garantir que os pesquisadores estejam qualificados e usem equipamentos de proteção individual adequados.
Após a coleta de morcegos ou carcaças fracas ou doentes, um ecologista de morcegos identificou a espécie morcego pelas características morfológicas do espécime. Envie uma folha de informações ao laboratório, incluindo o local de coleta, espécies, sinais clínicos e outros dados relevantes com cada amostra de morcego. Antes de iniciar a necroscopia, examine todos os orifícios externos e fotografe as características externas dos morcegos, especialmente a cabeça, orelhas e asas para diferenciação de espécies.
Para coletar uma amostra de cotonete oral coloque o morcego em recumbência ventral em uma placa de dissecção estéril e fixar a cabeça com pinças. Use um bisturi para cortar a pele ao longo da linha média da região da panturrilha; e puxe a pele para os lados laterais, para fazer uma incisão no crânio ao longo da linha média da área da panturrilha. Abra o crânio com pinças para expor o tecido cerebral e use a pinça para separar suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado.
Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e o cerebelo, e toque levemente a superfície cortada do tecido cerebral com lâminas de vidro para causar impressões de difamação. Pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido e fixar as lâminas de impressão de difamação em menos 20 graus celsius acetona por 30 minutos. Então conserte um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco, em formalina, para exame histopatológico.
E coloque o resto do tecido em emi-em 10 para extração de ácido nucleico. Em seguida, incisar a pele do coletor ao ânus ao longo da linha média do corpo, e usar a pinça para levantar e separar a pele e sublinhar tecidos musculares; para permitir a coleta das glândulas salivares, localizadas perto do osso mandibular. Levantar ligeiramente o esterno com a pinça, use o bisturi para cortar o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média e cortar as clavículas.
Use agulhas para fixar as caixas torácicas esquerda e direita na placa de dissecção, para abrir a cavidade torácica. E gravar as legiões brutas e o grau de mudança pós-morte. Em seguida, use a pinça e o bisturi para remover os tecidos viscerais conforme apropriado para a análise planejada a jusante.
Para realizar um teste de anticorpos fluorescentes diretos no final da fixação, seque os slides de impressão de difamação e selecione pelo menos dois anticorpos antirrábicas conjugados para a análise. Filtre um anticorpo em cada slide através de um filtro de 0,45 micrômetro. E incubar os slides por 30 minutos a 37 graus celsius em uma câmara úmida.
No final da incubação, drene o excesso de conjugado e lave os slides com PBS. Em seguida, use um pequeno volume de 10% de glicerol para montar deslizamentos de cobertura nos slides e imagem dos slides por microscopia de fluorescência. Quando o teste de anticorpos fluorescentes ou a análise RT-PCR indicar positividade, homogeneize a amostra cerebral na suspensão de 10% em emi-en 10 e sedimente os tecidos fleu-rry por centrifugação.
Inocular 200 microlitadores do super-nat-en com três vezes 10 a 6 células neuroblastomas do rato e um mililitro de emi-en 10 por uma hora a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono. E transfira a suspensão de células homogêneas cerebrais para um frasco quadrado de 25 centímetros, contendo seis mililitros de emi-en 10 frescos. Em um mililitro de suspensão de células homogêneas cerebrais em um deslizamento de vidro revestido de Teflon de quatro poços, com um diâmetro de seis milímetros e colocar o slide a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono por três a quatro dias.
Após fixação com 100% de acetona, colorir os slides com os mesmos anticorpos antirraiva conjugados de fluorescência, como usado para o teste de anticorpos de fluorescência. E visualize os slides por microscopia fluorescente para determinar o número de inclusões intracida-plas-mic. Depois de tentarpsinizar e subculturar a cultura celular inoculada de acordo com os protocolos padrão, devolva a cultura fria à incubadora de cultura celular por mais três a quatro dias com a repetição da contagem do número de células infectadas como apenas demonstrado até que uma infectividade de 100% seja alcançada.
De janeiro de 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Nesta análise representativa de dois casos positivos de morcegos, a impressão cerebral testada negativamente usando o teste de anticorpos fluorescentes com um dos anticorpos antirraiva conjugados comerciais, fit-sy, enquanto o RT-PCR empregando cada um dos dois conjuntos de primer diferentes, produziu resultados positivos. A sujeição da sequência ampli-con obtida para a consulta de explosão no banco de dados do banco Gen revelou que a sequência era semelhante aos Lyssaviruses com identidades inferiores a 79% que suportam as identidades dos Lyssaviruses detectados.
Dois Lyssaviruses foram posteriormente isolados com sucesso dos dois cérebros, confirmados pelo teste de anticorpos de fluorescência e sequenciamento. O passo chave para determinar a positividade do Lyssavirus são o teste de anticorpos de fluorescência e a análise de RCP. O uso de dois ou mais anticorpos antirrábica nos conjuntos de primer é altamente recomendado.
Além do Lyssavirus, outros patógenos de morcego não-ical do zoológico podem ser monitorados usando métodos diagnósticos fechados. Os dados podem então ser usados para informar o público sobre evitar contato com morcegos. Quanto mais pudermos estudar o Lyssavirus morcego, mais seremos capazes de entender sua evolução e impacto na saúde pública.
