Astyanax mexicanus, também conhecido como o peixe-caverna mexicano cego, está emergindo como um organismo modelo para uma variedade de campos de pesquisa em ciência biológica, especificamente na compreensão da evolução dos traços genéticos adaptativos. Esta espécie consiste em uma morfa da superfície que habita o rio e uma morfina que habita cavernas, permitindo-nos analisar como duas populações da mesma espécie divergiram ao longo do tempo. No entanto, para que esta pesquisa ocorra, devemos ser capazes de obter embriões saudáveis com tempo e outcrosses híbridos.
Embora esta espécie seja facilmente mantida e criada em laboratório, os peixes desovam principalmente durante as horas noturnas, tornando desafiador obter embriões recém-colocados durante o dia. Neste protocolo mostramos como, aclimatando astyanax mexicanus a ciclos de luz alterados e mudanças de temperatura, somos capazes de mudar os ciclos de reprodução para uma hora mais conveniente do dia. Em seguida, mostramos como identificar peixes-mãe adequados e coletar gametas de machos e fêmeas anestesiados.
Finalmente, demonstramos como produzir descendentes viáveis usando fertilização in vitro e discutir sinais de fertilização bem sucedida. Esperamos que este protocolo permita que procedimentos como a injeção de construtos genéticos e análises de desenvolvimento sejam facilmente conduzidos durante o horário normal de trabalho. Além disso, essa técnica pode ser útil para criar outcrosses híbridos entre todas as cavernas e populações que habitam a superfície.
Configure tanques de peixe dentro de um sistema de aquicultura opaco e totalmente fechado contendo múltiplas fileiras de tanques. Mantenha a temperatura de cada tanque com um elemento de aquecimento independente que é usado para alterar manualmente a temperatura durante o processo de escoramento. Configure linhas individuais de forma a habilitar fotoperióduos separados em cada um deles.
Instale portas em cada linha que possam ser fechadas para evitar que a luz entre ou escape. O controlador automatizado pode permitir a manipulação de todos os fotoperióduos com a menor perturbação ao peixe. Equipar o rack com uma luz vermelha de trabalho e cortinas de apagão para acesso durante horas escuras.
Remova os peixes desejados dos racks do sistema geral e coloque em racks de reprodução para permitir o ajuste do fotoperiodo 14 dias antes da escorva. Isso permite que o peixe se aclimata em um novo ambiente. Mantenha o peixe a 22,8 graus Celsius durante este período usando o sistema de aquecimento aquático instalado.
O fotoperíodo normal é de seis a.m. a oito p.m luz, e oito p.m.
a seis a.m.escuro. Para o rack de ciclo de luz, mude o fotoperíodo para 10 p.m. para 12 p.m.
luz, e 12 p.m. a 10 p.m. escuro, ajustando o temporizador que alimenta a luz dentro do rack.
Uma vez que os peixes são aclimatados comece a preparar os animais para desova. Este é um procedimento que leva seis dias no total. Ao longo deste tempo, altere a temperatura para preparar a produção de ovas usando um sistema de aquecimento aquático instalado.
No primeiro dia, eleve a temperatura de 22,8 graus Celsius para 24,4 graus Celsius. No segundo dia, eleve a temperatura de 24,4 graus Celsius para 26,1 graus Celsius. Nos dias três e quatro manter a temperatura em 26,1 graus Celsius.
Os peixes estarão prontos para desovar durante o dia e a FIV pode ser realizada. No quinto dia, a temperatura baixou de 26,1 graus Celsius para 24,4 graus Celsius. No sexto dia, a temperatura baixou de 24,4 graus Celsius para 22,8 graus Celsius.
Forneça uma diferença de sete dias antes de repetir este ciclo de temperatura. Recomendamos continuar a manter o peixe neste fotoperóuodo, uma vez que isso reduzirá o tempo total necessário pelos peixes para se ajustar ao ciclo de luz deslocado. Comece inserindo um lenço umedecido de tecido em uma tampa de placa de Petri e fechando a placa para criar uma câmara umidificada e evitar que o ova seque durante o processo de coleta.
Em seguida, escolha uma fêmea para a coleção. Peixes gravid com grandes abdômens salientes provavelmente serão a melhor escolha para este procedimento. Imobilize uma fêmea usando água gelada e coloque-a em posição supina em um suporte de animal esponja umedecido.
Uma vez posicionado o lado ventral do peixe com um delicado lenço de tecido como contato com a água fará com que o ova seja ativado. Segure a fêmea entre o polegar e o dedo indicador. Aperte suavemente os lados laterais da cavidade coelomic na direção da abertura urogenital enquanto rola ligeiramente o dedo.
Colete o ova expresso usando uma espátula descartável. Transfira isso para a placa de Petri umidificada. Várias embreagens de ova podem ser combinadas no mesmo prato se dados específicos de parentalidade não forem necessários.
Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água do sistema. Escolha um macho para a coleção. Não há sinais externamente visíveis de qualidade masculina de jogo.
No entanto, os peixes devem parecer saudáveis na aparência antes do uso neste procedimento. Imobilize um macho usando água gelada e coloque-o em posição supina em um suporte de animal esponja umedecido. Borrigue o lado ventral do peixe com uma delicada limpeza tecidual, pois o contato com a água ativará o milt.
Coloque suavemente a extremidade de um tubo capilar na abertura urogenital. Expele milt aplicando pressão suave nas laterais do peixe com o polegar e o dedo indicador. Comece a distal para as brânquias movendo-se em direção à abertura urogenital.
Colete o milt na ponta de um tubo capilar. Sucção suave pode ser necessária pelo uso de um tubo aspirador. Evite fezes que possam ser expelidas com o milt.
Distribua o milt em um tubo vazio de centrífuga de 1,5 mililitro e dilua com o dobro do volume do extensor de esperma E400. Mantenha-se no gelo. Milt de vários machos pode ser agrupado se dados específicos de parentesco não forem necessários.
Esta etapa pode ser usada para estender o tempo de trabalho do milt por várias horas, mas não é necessária para fertilização imediata. Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água do sistema. Usando uma nova pipeta para cada estoque misture o esperma por pipetar e/ou agitar as laterais do tubo antes de fertilizar como esperma e milt e se instalar na solução E400 ao longo do tempo.
Dispense a solução milt ou milt estendida no ovário recém-coletado. Adicione rapidamente um mililitro de água do sistema à embreagem para ativar o esperma e os óvulos para fertilização. Evite misturar ou agitar o conteúdo do prato e deixe dois minutos para que a fertilização ocorra.
Adicione mídia de embrião E2 para encher o prato 2/3 cheio. Dependendo do procedimento subsequente, os embriões podem ser usados imediatamente para aplicações a jusante ou podem ser incubados em mídia de embriões E2 a 23 graus Celsius até atingirem cinco dias após a fertilização. Neste ponto, transferimos embriões para o sistema habitacional principal recirculando usando água do sistema.
A maior força deste método é a produção confiável de híbridos de cavernas e superfícies de Astyanax mexicanus. Métodos convencionais de produção híbrida são muito desafiadores devido à perda do ritmo circadiano no morfótipo das cavernas de Astyanax mexicanus, o que resulta em tempos alterados de desova desses peixes. Para um procedimento de FIV bem sucedido em Astyanax mexicanus a qualidade do ovado coletado é de grande importância.
Peixes fêmeas gravid com grandes abdômens salientes são mais propensos a liberar ovas viáveis, que parecem claros e até mesmo na aparência. Adicionar o milt coletado a tais óvulos resulta no desenvolvimento de embriões fertilizados geralmente dentro de 20 a 30 minutos. Embriões viáveis se tornarão um pouco mais translúcidos antes de entrar em um estágio celular do ciclo de desenvolvimento.
Ovas não fertilizadas parecerão mais desiguais e opacas. Usando FIV para gerar híbridos de peixes-caverna tenaja e peixes superficiais pode-se examinar uma ampla gama de fenótipos morfológicos. Por exemplo, híbridos de superfície/caverna têm olhos indicando que a presença dos olhos é um traço dominante.
Na caverna de superfície híbridos F2, no entanto, obtemos uma ampla gama de tamanhos oculares indicando que existem vários loci que controlam o tamanho dos olhos em Astyanax mexicanus tornando-o um traço quantitativo. Outro exemplo é a pigmentação. Observando o F1 híbrido de superfície e peixe-caverna, pode-se concluir que a pigmentação corporal é um traço dominante, pois os peixes são totalmente pigmentados.
Na geração F2, a variação da pigmentação corporal aponta novamente para um traço quantitativo. A combinação desses dados fenotípicos com dados de sequenciamento pode revelar loci genético subjacente responsável por esses fenótipos. Neste protocolo aprendemos como mudar os ciclos de reprodução de Astyanax mexicanus para horas mais convenientes do dia, e obter embriões viáveis saudáveis usando fertilização in vitro.
Além de permitir trabalhos com embriões em estágio inicial, também permite a exploração futura da criopreservação de esperma. A padronização dessa técnica fortalece a Astyanax mexicanus como um sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento precoce.
