Os animais das cavernas fornecem um sistema convincente para investigar diversos traços morfológicos, de desenvolvimento e comportamentais. Mas um dos fatores limitantes no estabelecimento desse sistema modelo é a falta de ferramentas genéticas que nos permitam manipular a função genética. Aqui demonstramos três abordagens diferentes para manipular a função genética no peixe-caverna mexicano, Astyanax mexicanus.
Essas ferramentas permitirão a investigação dos genes subjacentes às variações naturais entre peixes superficiais e peixes-caverna e como eles se relacionam com fenótipos. Bethany Stahl, uma talentosa pós-doutora no meu laboratório, demonstrará esse procedimento. Antes de iniciar o procedimento, encha uma placa de Petri de 100 mililitros com 3% de agarose quente dissolvido na água do sistema de peixes e coloque cuidadosamente um molde de injeção de ovo na agarose em um ângulo de 45 graus, antes de baixar lentamente o molde para a ágarose para evitar prender o ar sob o molde.
Quando a agarose tiver solidificado, remova cuidadosamente o molde e armazene a placa a quatro graus Celsius por até uma semana. Em seguida, puxe agulhas de capilares de vidro borossilicato e um puxador de agulha de eletrodo de acordo com as diretrizes do fabricante. No dia da injeção, use uma pipeta de vidro para transferir ovos de célula única para a placa de injeção, preenchendo até cinco fileiras da placa de injeção com 30 a 40 ovos por linha.
Mantenha os ovos hidratados com uma pequena quantidade de água do sistema de peixes. Descongele Morpholino no gelo e prepare a solução de injeção para que 400 picogramas de Morpholino seja injetado por ovo usando uma longa ponta de pipeta Microloader ou adicionando um bolus de dois a quatro microliter ao final. Quando todas as agulhas tiverem sido carregadas, use fórceps para cortar o comprimento excessivo das pontas da agulha de injeção e montar a primeira agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor picoliter.
Em seguida, coloque o prato de injeção sob um microscópio dissecando e use o micromanipulador para penetrar cada ovo com a agulha antes de injetar um nanoliter de solução de injeção de Morpholino diretamente na gema. Para injeção CRISPR, misture 25 picogramas de RNA guia com 300 picogramas de RNA mensageiro de proteína CRISPR 9 e injete dois nanoliters da solução de RNA resultante em cada embrião, conforme demonstrado. Para tol2 transposase e tol2 injeção plasmida flanqueada, combine 25 nanogramas por microliter de Tol2 mensageiro RNA com 25 nanogramas por microliter de tol2 construção plasmid e vermelho fenol em água livre de RNase.
Em seguida, injete um nanoliter de solução em cada embrião como apenas demonstrado. Para rastrear os animais injetados por Morpholino a quatro dias após a injeção, dependendo do gene de interesse, visualize as larvas de peixe sob um microscópio estéreo para observar o fenótipo dos animais injetados ou registro de vídeo para medir o comportamento. Para testar os indels crispr, transfira embriões injetados por CRISPR em tubos PCR e extraia o DNA de acordo com protocolos padrão de extração de DNA para reação em cadeia de polimerase ou análise de PCR.
Para avaliar a mutagênese, execute cinco microliters do produto PCR em um gel de 3%agarose a 70 volts por três horas. O DNA não mutagenizado do tipo selvagem resultará em uma banda distinta, enquanto o DNA mutante resultará em uma banda manchada. Caverna Um mexicano injetado com um controle Morpholino exibe significativamente mais atividade locomotor e reduziu o sono durante um período de 24 horas, em comparação com peixes superficiais injetados com um Morpholino mexido.
A injeção da orexina de hipocretina Morpholino tem pouco efeito no sono em peixes superficiais em comparação com peixes injetados no controle. Em contraste, a derrubada da orexina hipocretina através da injeção de Morpholino tem um efeito significativo no sono em peixes que habitam cavernas, fornecendo uma ligação direta entre a expressão de orexina hipocretina e a perda de sono. Mutagênese mediada por CRPSR do gene albinismo OCA2 em peixes superficiais resulta em alguns indivíduos homozigos para o alelo positivo OCA2 tipo selvagem, e está associado à pigmentação de abrigar, enquanto indivíduos que têm duas cópias do alelo negativo OCA2 mutado por CRISPR são albinos, fornecendo uma ligação direta entre o gene mutante OCA2 e o albinismo em peixes de caverna.
Selecione o F0 positivo para o Transgene transmitido tol2 para voltar para o tipo selvagem para gerar linhas estáveis de F1. Isso permite imagens de cálcio ao vivo para descobrir diferenças na atividade neuronal, mediando mudanças comportamentais no ambiente das cavernas, lançando as bases para a expressão de muitos transgenes adicionais para caracterizar e manipular a função genética em Um mexicano. As coisas mais importantes a se lembrar são carregar os ovos firmemente sobre a placa, aparar a agulha corretamente e otimizar a microinjeção.
Após um knockdown genético bem sucedido, integração transgênica ou edição de genes mediada pelo CRISPR, esses peixes podem ser usados para análises de desenvolvimento, comportamento e atividade cerebral.
