Este protocolo ATAC-seq modificado introduz um novo tampão de lise que diminui a contaminação das leituras mitocondriais de 50% para menos de 3%A diminuição da contaminação mitocondrial permitirá aos pesquisadores realizar um ATAC-seq mais eficiente com uma redução de 50% nos custos de sequenciamento. Validamos este novo protocolo ATAC-seq em PBMCs primários humanos, monócitos primários humanos, células dendríticas de camundongos e linhas celulares de melanoma. Acreditamos que será eficaz em uma ampla gama de tipos de células.
Minimizar a perda de amostras durante o processo de ativação e seleção celular é fundamental para obter resultados de alta qualidade com ATAC-seq. Vamos demonstrar como lidar com um pequeno número de células de amostras preciosas usando equipamentos básicos de laboratório. Para começar, descongele um frasco de células CD4+T anteriormente isoladas em um banho de água Celsius de 37 graus até que o gelo derreta.
Em seguida, transfira suavemente as células para um tubo cônico de 15 mililitros contendo nove mililitros de RPMI completo pré-aquecido. Centrifugar as células a 1.500 vezes G, e quatro graus Celsius, por seis minutos. Em seguida, descarte o supernasce e retire suavemente a pelota em dois mililitros de RPMI completo.
Depois de repetir a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque suavemente as células em 0,5 mililitros de RPMI completo. Use um hemótmetro para contar as células. Usando RPMI completo, ajuste a densidade de suspensão celular para a placa 50,000 células CD4+em 200 microliters por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.
Em seguida, para preparar contas magnéticas, alíquota de 12,5 microliters de contas Humanas T-Activator CD3/CD28 por amostra ATAC-seq para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de 1x PBS ao tubo, e coloque-o em um ímã por um minuto para lavar as contas. Remova e descarte cuidadosamente o supernanato claro e remova o tubo do ímã.
Resuspenja as contas em 13 microliters de RPMI completo por amostra ATAC-seq. Para ativar as células CD4+T com a concentração ajustada, colete 500.000 células em 2,1 mililitros de meio RPMI completo em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 12,5 microliters de contas T-Activator Humanas, preparados e lavados em etapas anteriores, e misture suavemente invertendo o tubo.
Em seguida, transfira suavemente as células, com contas, para um reservatório estéril. Usando uma pipeta multicanal, placa 200 microliters de células com contas por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços, e incubar em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2 por 48 horas. Após a incubação completa, centrifufique a placa a 423 vezes G, e temperatura ambiente, por oito minutos.
Remova 100 microliters de meio de cada poço e colete-o em um tubo cônico antes de descartar, a fim de confirmar nenhuma perda de contas. Em seguida, resuspenja a pelota celular nos 100 microliters restantes de médio, e colete tudo em um tubo de 1,5 mililitro. Para isolar as células CD4+, adicione 50 microliters de contas conjugadas CD4 pré-lavadas a 500.000 células em um mililitro de RPMI completo, e inverta para misturar.
Incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius, enquanto aperta a mão a cada seis minutos para misturar. Coloque o tubo sobre o ímã por dois minutos, até que o supernasce esteja limpo e, em seguida, remova e descarte. Remova o tubo do ímã.
Lave as células ligadas a contas reutilizando-as em um mililitro de PBS, mais 2% FCS, e coloque o tubo de volta no ímã por um minuto. Descarte o supernatante claro e repita este processo para um total de três lavagens. Após a lavagem final, coloque o tubo no ímã por um minuto.
Remova-o, descarte o supernasce e coloque a pelota no gelo. Em seguida, para realizar o isolamento dos núcleos, resuspensar as contas e células em 50 microliters de tampão de lise fria, e centrífuga imediatamente a 500 G, quatro graus Celsius, por 10 minutos. Remova e descarte o supernaspe.
Para realizar a reação transposase, resuspenja a pelota de núcleos isolados com 50 microliters de mistura de transposase Tn5. Incubar em um termociclador por 30 minutos a 37 graus Celsius, com a tampa definida para 40 graus Celsius, e depois manter a quatro graus Celsius quando completa. Imediatamente após o termociclismo, realize um rápido spin-down de centrífuga de bancada.
Coloque o tubo sobre o ímã por um minuto para remover as contas do produto. Sem remover o tubo do ímã, transfira o supernatante claro para uma coluna de purificação de DNA. Lave a coluna uma vez com 250 microliters de tampão PB, e duas vezes com 750 microliters de tampão pe.
Em seguida, adicione 10 microliters de tampão de elução para eluto da amostra. Configure a reação inicial de amplificação do PCR em um tubo PCR sem nuclease. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa de amplificação do PCR.
Em seguida, complete a amplificação final do PCR dos 45 microliters restantes da reação pcr, conforme descrito no manuscrito. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa. Após a amplificação completa, purifique as bibliotecas usando um kit de limpeza PCR, seguindo o protocolo do fabricante, eluindo em 25 microliters do buffer de elução.
Sequencie as bibliotecas preparadas em um sequenciador de próxima geração para uma profundidade de leitura média de 42 milhões de leituras por amostra. Este protocolo ATAC-seq melhorado produziu uma biblioteca final de mais de um nanograma por microliter para sequenciamento. O controle de qualidade mostrou fragmentos de DNA entre 200 e 1.000 pares de base, e mais sequenciamento foi realizado com essas bibliotecas de alta qualidade.
As bibliotecas preparadas seguindo este protocolo mostraram apenas 3% de contaminação mitocondrial. A alta porcentagem de leituras utilizáveis é suficientemente constante em todas as réplicas biológicas. Este protocolo forneceu resultados altamente reprodutíveis através de réplicas técnicas, bem como réplicas biológicas.
Além disso, este protocolo levou 48 horas, em vez de uma semana ou mais como descrito anteriormente, resultando em ativação consistente e eficiente, como demonstrado pelos resultados de sequenciamento reprodutível. Além disso, os picos atac-seq previstos foram chamados com precisão pelo pipeline de análise. A análise do resultado do sequenciamento revelou mudanças claras no estado da cromatina durante a ativação da célula T humana.
Foram identificadas regiões de cromatina aberta entre seis amostras antes e 48 horas após a ativação. Certifique-se de que a reação de lise dos núcleos seja realizada com reagentes e materiais refrigerados, a fim de maximizar a recuperação de núcleos intactos. Nosso tampão de lise de núcleos modificados é mais suave nas células, e minimiza contaminar o DNA mitocondrial.
Estamos ansiosos para que este tampão de lise modificado seja aplicado em núcleos únicos ATAC-seq também. Sabemos que este protocolo permitirá que os pesquisadores produzam dados ATAC-seq de maior qualidade a um custo reduzido, ajudando a encaminhar o campo epigenético. O protocolo é simples, rápido e não requer reagentes ou instrumentos perigosos, tornando-o facilmente acessível para aqueles novos para ATAC-seq.
