この改変ATAC-seqプロトコルは、ミトコンドリアの汚染読み取りを50%から3%未満に減少させる新しいリシスバッファーを導入し、ミトコンドリア汚染の減少により、研究者はシーケンシングコストの50%減少でより効率的なATAC-seqを実行することができます。我々は、ヒトの一次PBMC、ヒト一次単球、マウス樹状細胞、および黒色腫細胞株におけるこの新しいATAC-seqプロトコルを検証した。幅広い細胞種に効果があると考えています。
ATAC-seqを使用して高品質の結果を得るためには、細胞の活性化および選択プロセス中のサンプル損失を最小限に抑えることは重要です。基本的な実験装置を用いて、貴重なサンプルから少数の細胞を扱う方法を実演します。まず、氷が溶けるまで、以前に単離されたCD4+T細胞のバイアルを37°Cの水浴で解凍します。
その後、細胞を9ミリリットルの完全RPMIを含む15ミリリットルの円錐管にそっと移します。細胞を1、500倍G、摂氏4度で6分間遠心分離する。その後、上清を捨て、完全なRPMIの2ミリリットルにペレットを穏やかに再懸濁する。
遠心分離を繰り返した後、上清を捨て、完全なRPMIの0.5ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁する。細胞を数えるために、ヘモサイトメーターを使用してください。完全なRPMIを使用して、96ウェルの丸底プレートのウェルあたり200マイクロリットルの50,000 CD4+セルに細胞懸濁密度を調整します。
次いで、磁気ビーズを調製し、1.5ミリリットルチューブに対して1.5ミリリットルのチューブに対して、ヒトT-アクティベーターCD3/CD28ビーズのアリコート12.5マイクロリットルをATAC-seqサンプルに調製した。1倍のPBSをチューブに1ミリリットル加え、磁石の上に1分間置いてビーズを洗います。清澄上清を慎重に取り出して捨て、マグネットからチューブを取り出します。
ATAC-seqサンプル当たり完全なRPMIの13マイクロリットルでビーズを再懸濁します。調整された濃度でCD4+T細胞を活性化するには、15ミリリットルの円錐管に完全なRPMI培地の2.1ミリリットルで500,000細胞を集める。12.5マイクロリットルのヒトT-アクティベータービーズを追加し、前のステップで調製して洗浄し、チューブを反転して穏やかに混合します。
その後、ビーズで細胞を滅菌貯蔵所に静かに移します。マルチチャネルピペットを使用して、ラウンドボトム96ウェルプレートのウェルあたりビーズを含む200マイクロリットルのセルをプレートし、37°C、5%CO2インキュベーターで48時間インキュベーターします。完全なインキュベーションの後、423倍Gでプレートを遠心分離し、室温を8分間処理する。
各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り出し、ビーズの損失を確認するために、廃棄する前に円錐形のチューブに集めます。次に、培地の残りの100マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのチューブにすべてを集める。CD4+細胞を単離するには、完全なRPMIの1ミリリットルで500,000個の細胞にあらかじめ洗浄されたCD4コンジュゲートビーズ50マイクロリットルを加え、反転して混合します。
摂氏4度で20分間インキュベートし、6分ごとに手でフリックして混ぜます。上清がはっきりするまでチューブをマグネットに2分間置き、取り出して捨てます。マグネットからチューブを取り外します。
ビーズ結合細胞をPBSの1ミリリットルに加えて2%FCSで再懸濁して洗浄し、チューブを磁石に1分間戻します。透明な上清を捨て、このプロセスを合計3回の打ち上げに繰り返します。最後の洗浄の後、マグネットにチューブを1分間置きます。
それを取り除き、上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、核単離を行うために、50マイクロリットルの冷たいリシスバッファーでビーズおよび細胞を再懸濁し、遠心分離機を500G、摂氏4度で直ちに10分間再懸濁する。上清を取り除き、捨てます。
トランスポザーゼ反応を行うために、分離された核ペレットを50マイクロリットルのTn5トランスポザーゼミックスで再懸濁する。サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートし、蓋を摂氏40度に設定し、完成したら摂氏4度で保持します。サーモサイクリングの直後に、素早いベンチトップ遠心分離機のスピンダウンを行います。
チューブをマグネットに1分間置き、ビーズを製品から取り除きます。マグネットからチューブを取り外さずに、透明な上清をDNA精製カラムに移します。250マイクロリットルのPBバッファーでカラムを1回洗浄し、750マイクロリットルのPEバッファーで2回洗浄します。
その後、溶出バッファーの 10 マイクロリットルを追加して、サンプルを溶出します。ヌクレアーゼを含まない PCR チューブに初期 PCR 増幅反応を設定します。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、PCR 増幅プログラムを実行します。
次に、原稿に記載されているように、残りの45マイクロリットルのPCR反応の最終的なPCR増幅を完了する。PCR チューブをサーモサイクラーに入れ、プログラムを実行します。完全な増幅後、PCRクリーンアップキットを使用してライブラリを浄化し、メーカーのプロトコルに従い、溶出バッファーの25マイクロリットルで溶出します。
サンプルごとに平均読み取り深さ 4,200 万読み込みまで、次世代シーケンサー上の準備済みライブラリをシーケンスします。この改良されたATAC-seqプロトコルは、シーケンシング用にマイクロリットル当たり1ナノグラム以上の最終ライブラリを生成した。品質管理は、200と1,000塩基対の間のDNA断片を示し、さらにシーケンシングは、これらの高品質のライブラリで行われました。
このプロトコルに従って作製されたライブラリーは、わずか3%ミトコンドリア汚染を示した。使用できる読み取りの高い割合は、生物学的複製全体で十分に一定です。このプロトコルは、生物学的複製だけでなく、技術的な複製全体にわたって非常に再現性の高い結果を提供しました。
さらに、このプロトコルは、前述のように1週間以上ではなく48時間かかり、再現可能なシーケンスの結果によって示されるように、一貫した効率的な活性化をもたらしました。さらに、予測されたATAC-seqピークは、分析パイプラインによって正確に呼び出されました。シーケンシング結果分析は、ヒトT細胞活性化中のクロマチン状態の明確な変化を明らかにした。
開いたクロマチンの差動可能な領域は、活性化の前と48時間後の6つのサンプルの間で同定された。核の回収を最大限にするため、核の反応を冷やされた試薬と材料で行ってください。当社の修飾核リシスバッファーは、細胞に優しく、ミトコンドリアDNAの汚染を最小限に抑えます。
この改変されたライシスバッファーが単核ATAC-seqにも適用されることを楽しみにしています。このプロトコルは、研究者がコストを削減して高品質のATAC-seqデータを生成し、エピジェネティック分野を前進させるのに役立つことを知っています。このプロトコルは簡単で迅速で、危険な試薬や機器を必要としないため、ATAC-seqに新しい人にとっては簡単にアクセスできます。
