Para doenças neonatais como cardiomiopatia, a terapia regenerativa usando células-tronco pluripotentes induzidas tem um enorme potencial. No entanto, o crescimento acelerado das células in vitro leva a danos no DNA por metabólitos acumulados, como espécies reativas de oxigênio. Transplantar essas células danificadas pelo DNA resultaria em má engrafia e regeneração do órgão.
Antes do transplante, a qualidade das células deve ser avaliada. Aqui fornecemos dois protocolos passo a passo para avaliar os danos de DNA em células-tronco. Os procedimentos serão Jessica Miller, pesquisadora, Nikhil Mardhekar, pesquisadora, e Vasanthi Rajasekaran, técnica de laboratório.
Para começar, coloque 500 miligramas de agarose de baixo derretimento em 100 mililitros de água livre de DNA-RNA. Aqueça a garrafa em um forno de micro-ondas até que a ágarose se dissolva. Em seguida, coloque a garrafa em um banho de água de 37 graus Celsius até que seja necessário.
Para preparar slides de cometas pré-revestidos, coloque algumas gotas de 0,5% em um slide de vidro. Espalhe imediatamente a agarose para formar uma fina camada de revestimento de agarose usando um deslizamento de tampa. Trabalhando sob condições de baixa luz para evitar danos celulares ultravioletas induzidos pela luz, misture 10 microliters de suspensão celular e 90 microliters de solução agarose em um tubo.
Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius para evitar que a agarose se solidifique. Misture a solução sem introduzir bolhas de ar e pipeta 70 microliters por ponto no slide do cometa pré-revestido. Usando uma ponta de pipeta, espalhe a mistura de agarose celular para formar uma camada fina.
Coloque o slide em quatro graus Celsius por 15 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o deslizamento em tampão de lise fria. Coloque o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por uma hora.
Substitua o tampão de lise por solução alcalina fria. Certifique-se de que os slides estão completamente submersos. Depois de deixar o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por mais 30 minutos, coloque o slide em um tanque de eletroforese horizontal.
Encha o tanque com tampão de eletroforese alcalina a frio até que os slides estejam completamente submersos. Aplique tensão a um volt por centímetro por 15 a 30 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o escorregador em água deionizada fria.
Depois de dois minutos, retire a água deionizada e adicione água deionizada fresca e, em seguida, repita esta etapa uma segunda vez. Em seguida, substitua a água deionizada por 70% de etanol frio. Depois de cinco minutos, remova suavemente o slide sem inclinar-o e deixe-o secar.
Uma vez seco, adicione 100 microliters de corante de DNA diluído em cada ponto, e espere 15 minutos em temperatura ambiente. Usando um filtro FITC em um microscópio de epifluorescência, tire imagens de 50 a 100 cometas no total por amostra. Cardiomiócitos derivados do iPS, como descrito no protocolo de texto.
Para ver os cardiomiócitos derivados do iPS em lâminas de câmara, primeiro descarte o meio de cultura dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione um mililitro de 0,25% Trypsin por poço, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique a placa sob um microscópio para desprendimento celular.
Em seguida, adicione um mililitro de CMM para parar o Trypsin. Coloque a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius e 200 vezes g. Descarte o meio, adicione um mililitro de CMM e resuspenque as células.
Conte as células e ajuste a contagem celular para obter dois milhões de células em 1,6 mililitros de CMM. Agora semente 200 microliters de suspensão celular por poço do slide de câmara de oito poços. Toque no slide suavemente para espalhar as células ao redor do poço.
Incubar as células a 37 graus Celsius. Para o tratamento de doxorubicina cardiomiócito derivado do iPS, descarte o meio de cultura dos poços de cardiomocíte derivados do iPS e lave as células com PBS. Trate as células com doxorubicina de um micromolar por quatro horas a 37 graus Celsius.
Aspire o meio e lave as células com PBS. Para realizar o imunolabelamento, lave as células três vezes com PBS e adicione 200 microliters de 4% de paraformaldeído recém-preparado a cada poço. Conserte as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente.
Depois de lavar as células com PBS, adicione 200 microliters de tampão de bloqueio por poço, e bloqueie por 30 minutos em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Remova o buffer de bloqueio e adicione 200 microliters da solução de anticorpos primários. Depois de incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente, lave os poços três vezes com PBS.
Remova o PBS e adicione 200 microliters de mistura de anticorpos secundários. Incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS.
Lave com água deionizada antes de montar os slides com antifado. Coloque um copo de cobertura e armazene os slides no escuro a quatro graus Celsius. Usando um microscópio confocal, pegue de três a cinco imagens de campos aleatórios por amostra e prossiga para análise de imagem.
Para contar os focos de resposta a danos de DNA, baixe e instale o CellProfiler. Selecione arquivo, importação, pipeline do arquivo e escolha o arquivo de pipeline chamado puncti gamma-H2AX. Arraste e solte a pasta contendo as imagens adquiridas de focos gama-H2AX para a janela de lista de arquivos na seção de imagens dos módulos de entrada para análise.
Em seguida, siga as instruções como mostrado no protocolo de texto. Para definir os parâmetros das imagens, arraste a imagem desejada para análise na lista de arquivos. Em módulos de entrada, selecione imagens.
Também em módulos de entrada, selecione metadados e selecione nomes e tipos. Para grupos, selecione não. Trabalhando em módulos de análise, selecione cor a cinza.
Em seguida, selecione suavemente, selecione identificar objetos primários e selecione novamente suavemente. Em seguida, selecione melhorar ou suprimir recursos e, em seguida, selecione identificar objetos primários. Ainda trabalhando em módulos de análise, selecione objetos de relação, depois classifique objetos e, finalmente, selecione exportar para planilha.
Clique em analisar imagens no painel inferior esquerdo para realizar a análise da imagem. Na conclusão bem sucedida da análise, várias imagens são geradas. Observe o arquivo CSV gerado e salvo no local apropriado no computador.
Este arquivo contém os dados quantitativos para análise posterior. Na planilha chamada minha imagem de experimento, a coluna B terá o número de núcleos que têm até cinco puncti, e a coluna D terá o número de núcleos que possuem mais de cinco puncti. Adicione as colunas B e D para obter o número total de núcleos.
Repita estes passos para todas as imagens, alterando o meu nome de arquivo de experimento antes de cada análise. Micrografos representativos de cometas de células iPS tratadas com doxo e não tratadas são mostrados aqui. Uma quantidade basal de dano de DNA foi encontrada em células iPS, expressas como uma fração de dano de DNA e momento da cauda.
No entanto, o tratamento do doxo aumentou o dano de DNA em células iPS como esperado, indicando que o ensaio do cometa pode ser usado para avaliar a integridade do DNA em células-tronco pluripotentes. Micrografos representativos da imunolabeling gama-H2AX são mostrados aqui, em menor ampliação e em maior ampliação. No controle de cardiomiócitos derivados do iPS, mais de 90% das células apresentavam menos de cinco focos de DDR por núcleos.
E um total de menos de 10% das células tinha mais de seis focos de DDR por núcleos. Para cardiomiócitos derivados do iPS cultivados por seis meses, menos de 90% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos, e um total de mais de 13% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Considerando que nos cardiomiócitos derivados do doxo iPS, menos de 80% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos.
E um total de cerca de 24% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Esses dados indicam que a cultura celular cardiomiócito derivada do iPS prolongada e o tratamento doxo induziram danos significativos no DNA, tornando-os inadequados para transplante celular. É muito importante evitar variáveis ao misturar a suspensão celular, pois isso pode afetar a eletroforese.
Após este procedimento, você pode realizar os ensaios do cometa e os procedimentos de imunolabeling com células de vários tipos. Essas técnicas permitirão que células de vários tipos sejam avaliadas para danos ao DNA antes de serem usadas em estudos de transplante celular.
