Este protocolo preenche uma lacuna técnica em nossa capacidade de gerar matrizes de sequência ultra-longa. Ele nos permite examinar a complexidade do genoma que é limitada pelas abordagens atuais de leitura curta em genômica. O método é único em desempenho, robustez, versatilidade e potencial de integração com novas aplicações promissoras.
É aplicável a diferentes materiais e pode ser modulado para diferentes tamanhos instantâneos. Essa técnica começou a revolucionar a paisagem clínica. Sua utilidade de diagnóstico em distúrbios de expansão repetidas superou muitas deficiências atuais.
Alguns registros de transplantes têm utilizado tipagem de HLA de alta resolução para melhor resultado clínico. Esses métodos fornecem informações de longo alcance previamente inacessíveis, como a eliminação e a variância estrutural complexa. Juntamente com a leitura epigenética em um único teste, ele permitirá a medicina de precisão.
É um protocolo longo com muitas novas técnicas e é difícil saber se está funcionando até o sequenciamento final. Recomendo praticar o carregamento em células de fluxo antigas antes de executar amostras. Colaboradores disseram que algumas técnicas são confusas em comparação com abordagens de leitura curta.
Especificamente, a extração é mais suave devido ao DNA de alto peso molecular de alta qualidade. Para iniciar a extração do DNA HMW, adicione primeiro 200 microliters da suspensão celular a 10 mililitros de tampão de lise em um tubo de 50 mililitros. Então, vórtice na velocidade mais alta por três segundos.
E incubar a solução a 37 graus celsius por uma hora. Ao final da incubação, adicione dois microliters de RNS-A ao lise. Gire suavemente o tubo de 50 mililitros para misturar a amostra e incubar a 37 graus celsius por uma hora.
Após a incubação, adicione 10 mililitros da camada fenol da mistura de álcool fenol-clorofórmio-isoamíl, ao liseto. E coloque o tubo em um rotador a 20 rpm por 10 minutos sob um capô de fumaça. Após a centrifugação com tubos de gel, despeje cuidadosamente o supernatante em um novo tubo de 50 mililitros.
Em seguida, adicione 25 mililitros de 100% de etanol gelado, e gire suavemente o tubo à mão, até que o DNA precipita. Dobre uma ponta de 20 microliter para fazer um gancho. Usando o gancho, retire cuidadosamente o DNA HMW e deixe o líquido cair.
Em seguida, coloque o DNA em um tubo de 50 mililitros contendo 40 mililitros de 70% de etanol, e inverta suavemente o tubo três vezes para lavar o DNA. Para preparar a biblioteca mecânica baseada em tesouras, primeiro use uma seringa sem agulha de 100 mililitros para aspirar todo o DNA. Em seguida, coloque uma agulha calibre 27 na seringa e ejete todo o DNA no prato suavemente e lentamente.
Repita 29 vezes. Em seguida, adicione 143 microliters das contas magnéticas re-suspensas e 143 microliters da mistura de reação de reparação de DNA a um tubo. Gire o tubo seis vezes para misturar suavemente, e coloque o tubo em um rotador a 20 rpm por 30 minutos.
Centrifugar o tubo a 1000G por dois segundos à temperatura ambiente para girar a amostra e, em seguida, coloque o tubo em um rack magnético por 10 minutos. Em seguida, descarte o supernatante enquanto o tubo ainda estiver no rack. Adicione 400 microliters do recém-preparado 70% de etanol.
Espere 30 segundos. E então remova o etanol. Em seguida, centrifugar o tubo a 1000G por dois segundos à temperatura ambiente para girar a amostra.
Coloque o tubo de volta no rack magnético e remova qualquer etanol residual. Seque a pelota por 30 segundos. Em seguida, remova o tubo do rack magnético e adicione 103 microliters de tampão T-E.
Em seguida, gire o tubo suavemente para garantir que as contas estejam cobertas no buffer e coloque o tubo no rotador em temperatura ambiente por 30 minutos. Por fim, coloque o tubo de volta no rack magnético por 10 minutos para pelotar as contas. Use uma ponta de furo de largura P200 para transferir 100 microlitadores do elunato para um tubo de 0,2 mililitro, e proceder a reações de reações de ligamento dA-tailing e adaptação de adaptador.
Para preparar a biblioteca baseada em fragmentação transposase, primeiro faça uma reação de tagmentação de DNA adicionando 22 microliters do DNA HMW, um microliter de 10 milimolar Triss, pH 8, com 0,02% Triton X-100, e 1 microliter da mistura de fragmentação, a um tubo de 0,2 mililitro. Em seguida, use uma ponta de furo de largura P200 para misturar a reação seis vezes, e incubar a 30 graus celsius por um minuto, seguido por 80 graus celsius por um minuto. Segure-se a quatro graus celsius.
Por fim, use uma ponta de furo de largura P200 para transferir a reação para um tubo de 1,5 mililitro e adicione rapidamente 1 microliter de mistura de adaptador rápido. Use uma ponta de furo de largura P200 para misturar a reação seis vezes. Incubar a reação à temperatura ambiente por uma hora, e proceder ao sequenciamento.
Para começar o sequenciamento, insira primeiro uma nova célula de fluxo em um dos canais do dispositivo Nanopore. Em seguida, no software de controle de sequenciamento que acompanha, verifique a caixa de localização da célula de fluxo. Selecione o tipo de célula de fluxo correta e clique no fluxo de fluxo da célula de verificação.
Clique no botão de teste iniciar para iniciar a análise QC da célula de fluxo. Em seguida, com uma pipeta P1000 definida para 100 microliters, retire menos de 30 microliters de buffer para remover bolhas da célula de fluxo. Adicione 30 microliters da mistura de escoramento para cobrir a parte superior da porta de escoramento para evitar a introdução de bolhas.
Em seguida, pipeta 800 microliters da mistura de priming na porta de escoramento para carregar a célula de fluxo. Tire a ponta quando houver cerca de 50 microliters da mistura de escoramento à esquerda, e adicione o resto da mistura de escoramento na parte superior da porta de escoramento. Em seguida, com uma pipeta P1000, adicione 200 microliters da mistura de escoramento na célula de fluxo.
Então, pouco antes do carregamento, use uma pipeta P200 definida para 80 microliters para pipeta para cima e para baixo na biblioteca de DNA seis vezes. Finalmente, carregue a mistura de biblioteca em termos de gota na célula de fluxo através da porta de amostra e prossiga para sequenciamento e análise de dados. A análise de DNA pronta para construção de bibliotecas mecânicas baseada em tesouragem resultou na razão de pureza de 260 a 280 de aproximadamente 1,9, e na razão de 260 a 230 de aproximadamente 2,3, mostrando uma boa amostra de DNA.
O mesmo resultado foi visto usando a construção da biblioteca baseada em fragmentação de DNA pronta para transposase. O controle de qualidade do DNA HMW da agulha por eletroforese de gel de campo de pulso mostrou que a maioria do DNA HMW era maior que 50 quilobases. Os resultados de quatro corridas usando a célula HG00733 mostraram que o N50 de uma biblioteca mecânica baseada em tesouras era menor do que uma biblioteca baseada em fragmentação transposase.
Além disso, todas as quatro corridas tinham mais de 2300 leituras com comprimento superior a 100 quilobases. O comprimento máximo foi maior nas bibliotecas baseadas em fragmentação transposase com seu menor tempo de preparação, em comparação com as bibliotecas mecânicas baseadas em tesouras. As bibliotecas mecânicas baseadas em tesouraria produziram mais leituras totais em comparação com as bibliotecas baseadas em fragmentação transposase, indicando um rendimento maior.
Ambas as bibliotecas apresentaram alta qualidade consistente e mais de 97% de suas bases totais estavam alinhadas com o genoma de referência humana. As distribuições de tamanho esperadas mostraram que todas as quatro corridas tinham uma grande proporção de dados acima de 50 quilobases, enquanto as bibliotecas baseadas em fragmentação transposase tinham uma proporção maior de leituras ultra-longas. O objetivo geral é manter o DNA intacto, por isso é importante evitar qualquer manuseio severo do DNA.
Um fator-chave que pode maximizar o valor do método é a análise computacional. Nossa equipe desenvolveu um pipeline de análise de leitura longa chamado PICKY que pode detectar uma gama completa de SVs com alta sensibilidade. Ele abrirá novos caminhos para áreas emocionantes, como detectar SVs complexas e rearranjos e modificações no nível de molécula única.
Isso melhorará muito nossa compreensão da arquitetura do genoma. O fenol é muito corrosivo. Você deve trabalhar com ele em um capô de fumaça com equipamento de proteção pessoal, incluindo luvas, óculos de segurança, um jaleco, calças compridas e sapatos.
