Reprogramação direta de linhagem de fibroblastos para células progenitoras eritrópicas. É um novo método que desenvolvemos em nosso laboratório para estudar melhor os processos de regulação transcricional determinando o destino das células eritróides. A principal vantagem em usar a reprogramação direta de linhagem para estudar o desenvolvimento é que é uma técnica muito simples.
Assim, em comparação com, por exemplo, a perda de estudos de função dentro de camundongos eliminatórios, aqui podemos muito facilmente manipular o fator, expressá-lo demais em determinado momento, e depois obter facilmente material suficiente para estudar efeitos a jusante, como modificações de cromatina ou mudanças de expressão genética. Embora este método se concentre na reprogramação de fibroblastos de ponta de cauda de rato para progenitores eritróides, ele também pode ser aplicado a outros tipos de células fibroblastos, e a outros organismos, incluindo humanos. As implicações dessa técnica se estendem para a medicina de transfusão, na forma de abrir caminho para a produção de glóbulos vermelhos in vitro.
Demonstrando o procedimento será Alban Johansson do meu grupo de pesquisa. Comece cobrindo a superfície dos pratos com 0,1% de gelatina. Incuba-os a 37 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos.
Aspire a solução de gelatina e deixe os pratos secarem. Use uma tesoura para cortar na base da cauda de um rato eutanizado para removê-lo. Coloque a cauda em DPBS com 2%FBS até estar pronta para uso.
Em uma capa de cultura de tecido em condições estéreis, prepare uma solução de trippsina diluída de 0,02% de trippsina EDTA em DPBS e adicione 5 mililitros em um prato de 10 centímetros não revestido. Em uma capa de cultura de tecido, lave a cauda em 70% de etanol em um tubo de 15 mililitros para cobri-lo e, em seguida, em DPBS. Coloque a cauda plana em um prato e use fórceps para mantê-lo no lugar.
Use um bisturi para fazer uma incisão na cauda ao longo de seu eixo longitudinal da base até a ponta. Use um par de fórceps para agarrar a cauda e segurá-la verticalmente e usar um segundo par para segurar a pele ao lado da incisão na base da cauda e descascá-la de volta. Faça isso em ambos os lados da incisão até que a pele possa ser descascada puxando para baixo em direção à ponta da cauda.
Segure a cauda descascada com fórceps sobre o prato contendo a solução de trippsina. Use uma tesoura de dissecção para cortar a cauda em pequenos pedaços. Use uma tesoura para fragmentar essas peças na solução de trippsina em pedaços ainda menores e, em seguida, incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Para saciar a trippsina, adicione dois volumes de fex médio, DMEM com suplementos e antibióticos. Colete o conteúdo inteiro do prato em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 350 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o supernascimento e resuspenha a pelota contendo os fragmentos de cauda em 10 mililitros de meio FEX fresco. Transfira esta suspensão para um prato revestido de gelatina. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 4% de oxigênio, adicionando um fex fresco a cada dois dias.
Observe a cultura após cinco a sete dias, em que os fragmentos da cauda se anexaram na parte inferior do prato, e os fibroblastos estão se afastando deles. Uma vez que os agrupamentos de fibroblastos são visíveis, agite suavemente o prato para desalojar peças de cauda. Aspire o meio com todos os fragmentos ósseos, deixando os fibroblastos presos à placa.
Adicione 10 mililitros de fex fresco e cultive os fibroblastos até confluentes. Para garantir que não haja contaminação por progenitores hematopoiéticos na cultura do fibroblasto, dissociar as células da placa usando trippsina EDTA como descrito no manuscrito. Adicione o meio e colete as células e adicione contas magnéticas com anticorpos.
Use um sistema de separação magnética para remover células expressando marcadores hematopoiéticos. Incluir esta etapa é absolutamente vital porque elimina quaisquer HSPCs que possam estar presentes na cultura e, portanto, a probabilidade de quaisquer falsos positivos no dia da análise facs. Células de embalagem retroviral de sementes a aproximadamente 25.000 células por centímetro quadrado em um prato tratado de cultura tecidual.
Incubar as células em DMEM de alta glicose a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite. Na manhã seguinte, remova o meio e adicione metade do volume usado para cultivar durante a noite do DMEM sem aditivos. À tarde, verifique as células quanto à confluência de 70 a 80% necessária para transfecção.
Inicie a transfecção preparando uma mistura de dois a um de seis microgramas do vetor de expressão PMX e três microgramas do vetor auxiliar contendo genes gag, pol e envelope para cada fator de reprogramação. Em seguida, para cada fator de reprogramação, adicione 300 microliters de DMEM de temperatura ambiente em um tubo de poliestireno estéril. Em seguida, adicione cuidadosamente 27 microliters de reagente comercial de transfecção de temperatura ambiente diretamente no meio para evitar o contato com a parede do tubo.
Adicione a mistura de plasmídeos no reagente de transfecção contendo tubo. Vórtice brevemente e incubar a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente. Vórtice a mistura de DNA do reagente transfecção novamente.
Adicione-o dropwise às células de embalagem retrovirais para que ela se espalhe uniformemente sobre a cultura e incubar a 37 graus Celsius. 24 horas após a transfecção, retire o médio e adicione DMEM com 20% FBS e 100 unidades por estreptomicina de penicilina mililitro. 48 horas após a transfecção, colete o supernascer e filtre-o através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 0,22 micrômetro.
Comece a transdução semeando os fibroblastos da ponta traseira a 10.000 células por centímetro quadrado em pratos pré-revestidos de gelatina de 0,1% em meio FEX. Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas. Ao realizar esta etapa, é importante adicionar os quatro supernantes retrovirais em uma proporção igual para garantir que todos os quatro transgenes contribuam igualmente para o processo de reprogramação.
No dia seguinte, prepare uma mistura de transdução adicionando primeiro um volume de supernanato viral para cada fator de reprogramação suplementado com quatro microgramas por mililitro de reagente de infecção retroviral a seis volumes de fex médio. Depois disso, aspire o meio FEX da cultura do fibroblasto e adicione a mistura de transdução. Incubar a reação de transdução por quatro horas a 37 graus Celsius em condições hipoxilicas a 5% de dióxido de carbono e 4% de oxigênio.
Após quatro horas, aspire a mistura de transdução e adicione meio de reprogramação fresco. Incubar a 37 graus Celsius em condições hipoxicas por oito dias, adicionando meio de reprogramação fresco a cada dois dias. Observe a reprogramação bem sucedida com aglomerados de células separadas da placa.
Para colher células reprogramadas do prato para análise mais aprofundada, pipeta-as suavemente para cima e para baixo e, em seguida, coletar as células. Após a reprogramação bem-sucedida dos iEPs, as células YFP positivos são observáveis até cinco dias após a transdução. Eles se tornam redondos, levantam da superfície da placa, começam a formar aglomerados, e exibem uma morfologia precursora eritróida.
A hemoglobinização de algumas células é evidente pela coloração positiva da benzidina. Uma pequena fração expressa o marcador de superfície específico do eritróide TER-119. No oitavo dia, grandes aglomerados YFP positivos podem ser vistos.
Dia 8, os IEPs têm um fenótipo eritródo mais diferenciado do que o quinto dia iEPs. Eles são significativamente menores, acumularam mais hemoglobina, e mostram maior expressão do TER-119. A análise da expressão genética por qPCR de iEPs coletados no oitavo dia mostra que eles quase desligaram a expressão de genes de fibroblasto e têm regulado muitos genes eritróid.
Depois de realizar ensaios de formação de colônias BFU-e nas células reprogramadas, os oito dias formam dois tipos de colônias, distintamente vermelhas e não visivelmente vermelhas. Enquanto as células das colônias vermelhas exibiam morfologia eritroblast, as células de colônias não vermelhas não. Aproximadamente um em cada 1.000 dias cinco iEPs formaram colônias vermelhas, enquanto apenas aproximadamente uma em cada 10.000 colônias se formaram a partir do oitavo dia iEPs.
A eficiência de reprogramação de fibroblastos de ponta traseira ou TTFs é influenciada pelo número de passagem. Os TTFs que haviam sido passagens nove vezes mostraram uma redução dramática na capacidade de produzir clusters de iEPs em comparação com as células que haviam sido passagemdas três vezes. Além disso, diferentes condições culturais podem afetar a eficiência da reprogramação.
Os TTFs transduzidos cultivados na normoxia são muito mais lentos para reprogramar e os clusters IEP são observados após 10 dias em vez de cinco a oito dias. Após esse procedimento, métodos como ensaios de formação de colônias, análise de qPCR e FACS podem ser aplicados para determinar o estado de diferenciação celular. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica está abrindo caminho para pesquisadores no campo da eritropoiese na compreensão da troca entre células eritróides primitivas e definitivas em camundongos e humanos.
