Esta técnica pode ajudar a responder perguntas-chave sobre fisiologia de nefrão único, incluindo as taxas de filtragem glomerular de proteínas sistêmicas e metabólitos e suas contribuições para a fisiologia tubular. A principal vantagem desta técnica de micropunctura é que ela permite o acesso ao espaço de Bowman e ao nefron cortical em todos os ratos. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutariam porque requer etapas de preparação corretamente executadas.
Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo, aplique pomada nos olhos e use fita adesiva para imobilizar as extremidades de um rato adulto de 20 a 25 gramas. Use um creme depilatório para remover todo o cabelo do lado esquerdo do animal, e use o baço esquerdo para localizar o rim esquerdo através da pele no lado dorsal e caudal do baço. Faça uma incisão de 0,5 centímetros na pele, seguida de uma incisão menor no peritônio apenas grande o suficiente para que o rim seja empurrado.
Extrude o rim com pressão suave e coloque uma forma de estabilizador renal polisiloxano ao redor do tecido. Forre o rim com o espaçador de tal forma que a superfície lateral do rim se estenda além do estabilizador em cerca de um milímetro, e fixe o rim à forma com adesivo de cianoacrilato. Cole uma placa da cabeça na forma estabilizadora e monte a placa da cabeça em barras de montagem na placa base.
Em seguida, preencha o poço no suporte de polisiloxano com uma solução de agarose de 1% e mantenha um deslizamento de cobertura de 10 milímetros em cima do formulário até que a agarose esteja firme. Sele o deslizamento da tampa na placa da cabeça com cola e crie um anel ao redor da tampa com cimento dental. Em seguida, injete de 100 a 150 microlitros do FITC-Dextran retro-orbitalmente e mova rapidamente o mouse e a placa de fixação para o estágio do microscópio de dois fótons.
Depois de focar manualmente na superfície dos rins, mude para o modo de dois fótons não escaneamento e explore a janela de imagem para localizar um glomerulus alvo que é superior a 30 micrômetros abaixo do deslizamento de cobertura e menos de 400 micrômetros da cápsula renal lateral. Regisso a distância lateral e vertical até o glomerulus alvo. Em seguida, grave as coordenadas de estágio x, y e z para o glomerulus.
E por último, levante o ponto focal objetivo cerca de um milímetro na coluna de água sem alterar as coordenadas de estágio x e y. Coloque a ponta da pipeta na coluna de água e ligue a excitação DAPI. Mova a pipeta nas dimensões x e y para o ponto de fluorescência máxima da ponta.
Este será o centro do objetivo. Altere a configuração x citação para proteína fluorescente vermelha e visualize a pipeta com o ocular para permitir um centro preciso na visão ocular. Mude de volta para dois fótons para encontrar a pipeta sob a visão ao vivo de dois fótons e coloque a ponta precisamente no centro da imagem, esta é a posição de registro.
Em seguida, salve uma imagem da pipeta e registre o estágio e as coordenadas do controlador de micropipette. Remova a pipeta da coluna de água no eixo x sem mover o eixo y e z e mova a pipeta z para a coordenada z-z alvo e a borda do rim. Observe o estágio x e calcule a pipeta de borda renal x usando o deslocamento da fase de registro x.
Aumente o estágio x para mover o palco em direção à pipeta até que a borda do rim esteja longe à esquerda da tela, enquanto permanece visível. Avance rapidamente a pipeta para cerca de 100 micrômetros de distância da pipeta de borda renal X acabou de calcular. Aumente o ganho vermelho e comece a avançar a ponta da pipeta lentamente para a borda dos rins sob imagens vivas de dois fótons enquanto monitora o histograma do pixel vermelho.
Dirija a pipeta no eixo x lentamente até o alvo glomerulus pipeta x, mantendo um olho no palco x. Ao chegar ao glomerulus, documente a posição com uma pilha de z. Com a pipeta em posição, ajuste a microbomba para injetar 100 nanoliters de perfluorodecalina ao longo de dois minutos.
Para garantir a patency da pipeta e reduzir a confusão da pipeta durante a entrada. Após quatro a seis minutos de filtragem, defina a microbomba para aspirar até 300 nanoliters a uma taxa de até 50 nanoliters por minuto. Este belo glomerulus de superfície próxima demonstra imagens favoráveis devido à posição superficial do glomerulus a 20 micrômetros abaixo da cápsula renal.
O glomerulus está muito perto da superfície para microinjeção, no entanto, como a pipeta iria bater o deslizamento de cobertura. Estes glomeruli são posicionados de forma ideal com as bordas laterais 250 micrômetros à direita e aparecendo menos afiados por causa da refração causada por sua profundidade de 70 micrômetros da cápsula. Ambos os fatores que tornam o glomeruli acessível.
Nesta imagem típica de entrada renal, uma projeção de intensidade média de uma pilha de z com vistas ortogonais revela a ponta da pipeta dentro do espaço de Bowman, note o artefato espectral da ponta de pipeta vermelha da fluorescência extremamente brilhante dos pontos quânticos dispostos na seção cônica da ponta. Aqui, uma renderização de volume de uma pilha z adquirida após o posicionamento de uma pipeta no espaço de Bowman, mostra a ponta de pipeta dentro do espaço abutting o tufo capilar. Se uma pipeta com uma abertura muito grande for usada, a cápsula renal pode quebrar causando sangramento subcapsular e entrada do sangue no lúmen pipeta.
Utilizando este método, 17 proteínas, principalmente de baixo peso molecular, foram identificadas a partir de um mínimo de dois peptídeos únicos por proteína. Juntamente com este método, outros métodos como maspectroscopia, medidas de eletrodos sensíveis a íons e injeção de anticorpos fluorescentes podem ser usados para responder a perguntas sobre o papel dos solutos luminais na fisiologia tubular e glomerular.
