Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по однонефроновой физиологии, включая гломерулярную скорость фильтрации системных белков и метаболитов и их вклад в трубчатую физиологию. Основным преимуществом этой техники микропунктюра является то, что он позволяет получить доступ к космосу Боумана и корковому нефрону у всех мышей. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, поскольку она требует правильно выполненных шагов подготовки.
После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, нанесите мазь на глаза и использовать ленту для обездвиживания конечностей от 20 до 25 граммов взрослой мыши. Используйте крем для удаления всех волос на левой стороне животного, и использовать селезенку, чтобы найти левую почку через кожу на спинной и хвостовой стороне селезенки. Сделайте 0,5-сантиметровый разрез в коже, а затем меньший разрез в брюшной полости достаточно большой для почки, чтобы быть проталкивается.
Выдавить почку с нежным давлением и поместить полисилоксановый стабилизатор почек форму вокруг ткани. Выровните почку вверх с spacer так что более десхальная поверхность почки удлиняет за стабилизатором около одним миллиметром, и фиксирует почку к форме с клеем cyanoacrylate. Клей головную пластину к форме стабилизатора и смонтировать головную пластину для монтажа баров на базовой пластине.
Затем заполните колодец в поддержке полисилоксана раствором агарозы и удерживайте 10-миллиметровую крышку на верхней части формы до тех пор, пока агароза не будет твердой. Печать крышки скольжения к голове пластины с клеем и создать кольцо вокруг крышки скольжения с зубным цементом. Затем ввините от 100 до 150 микролитров ретро-орбитальной FITC-Dextran и быстро переместит мышь и пластину фиксации на двухкотонную стадию микроскопа.
После ручного фокусировки на поверхности почек, переключитесь на несканируемый двухфотографий режим и исследуйте окно изображения, чтобы найти целевой гломерул, который больше, чем 30 микрометров ниже крышки скольжения и менее 400 микрометров от боковой капсулы почки. Завехать боковое и вертикальное расстояние до цели glomerulus. Затем зайдите координаты сцены x, y и z для glomerulus.
И, наконец, поднять объективный координационный центр примерно на один миллиметр в колонку воды, не изменяя координаты x и y stage. Заготовите наконечник пипетки в колонку воды и включите возбуждение DAPI. Перемести пипетку в размеры x и y до точки максимальной флуоресценции кончика.
Это будет центром цели. Измените настройку цитирования x на красный флуоресцентный белок и визуализируете пипетку с глазным, чтобы обеспечить точное центрирование глазного вида. Переключитесь на двух-фотон, чтобы найти пипетку под живым двух-фотоном зрения и разместить наконечник именно в центре изображения, это положение регистрации.
Затем сохраните изображение пипетки и зарегистрируйте координаты сцены и контроллера микропипеда. Удалите пипетки из колонки воды в х-оси, не перемещая y и z-оси и переместить пипетки z к цели glomerulus z-координаты и края почки. Обратите внимание на этап x и вычислите пипетку края почки x с помощью смещения от стадии регистрации x.
Увеличьте стадию x, чтобы переместить сцену к пипетке, пока край почки не будет далеко слева от экрана, оставаясь видимым. Быстро заранее пипетки около 100 микрометров от почки края пипетки X только что вычислил. Увеличьте красный усиления и начать продвижение пипетки кончик медленно к краю почки под живой двух-фотонной визуализации при мониторинге красный пиксель гистограммы.
Привод пипетки в x-оси медленно glomerulus целевой пипетки х, следя за сценой х. По достижении glomerulus, документ позиции с z-стек. С пипеткой в положении, установить микропамп для введения 100 нанолитров перфторекалина в течение двух минут.
Для обеспечения проходимости пипетки, а также уменьшить путаницу от пипетки подключения во время входа. После четырех-шести минут фильтрации установите микропамп для аспирации до 300 нанолитров со скоростью до 50 нанолитров в минуту. Этот красивый, вблизи поверхности glomerulus демонстрирует благоприятную визуализацию из-за поверхностного положения glomerulus на 20 микрометров ниже почечной капсулы.
Glomerulus слишком близко к поверхности для микроинъекции однако, как пипетка ударит крышку скольжения. Эти гломерули оптимально расположены с боковой краями 250 микрометров вправо и появляются менее острыми из-за преломления, вызванного их 70 микрометровой глубиной от капсулы. Оба фактора, которые делают glomeruli доступным.
В этом типичном изображении ввода почек, средняя проекция интенсивности от z-стек с ортогональными видами показывает наконечник пипетки в пространстве Боумана, обратите внимание на красную пипетку наконечник спектральный артефакт от чрезвычайно яркой флуоресценции квантовых точек расположены на конической части кончика. Здесь, объем рендеринга от z-стек приобрел после позиционирования пипетки в пространстве Боумана, показывает пипетку наконечник в пространстве, примыкающих капиллярный пучок. Если используется пипетка со слишком большим отверстием, почечная капсула может сломаться, вызывая субкапсулярное кровотечение и вход крови в люмен пипетки.
Используя этот метод, 17 белков, в первую очередь низкого молекулярного веса, были определены как минимум из двух уникальных пептидов на белок. В сочетании с этим методом, другие методы, такие как маспектроскопия, ионные чувствительные измерения электродов, и флуоресцентные инъекции антител могут быть использованы для ответа на вопросы о роли светящихся растворов в трубной и гломерулярной физиологии.
