Queremos agradecer Paquette Rebecca de assistência com a preparação de reagentes. MPM é apoiado por uma bolsa Ruth Kirchstein L. predoctoral dos Institutos Nacionais de Saúde e apoio de bolsas de GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP), também do National Institutes of Health.

1. Transferência adotiva de células: Veia da cauda ou injeção intra-ocular são métodos adequados para a introdução de células-tracker rotulados ou proteína fluorescente que expressam linfócitos. Neste vídeo. demonstramos transferência adotiva de células por injeção veia da cauda. a. Materiais Células T CD4 + são rotulados com 1,4 mM CFSE por 30 minutos a 37 º C, lavados duas vezes, e re-suspenso em 100 mL de RPMI-1640. Células são carregados em uma seringa de insulina estéreis 28 gauge para injecção. O número de células utilizado depende da experiência que está sendo feito. Normalmente, 5 milhões de células T são suficientes para a visualização de células T simples. Um limitador de roedores para o mouse é necessário para evitar danos ao animal e para si mesmo. b. Protegendo o animal O mouse é garantido para a transferência adotiva por lentamente apoio do animal para o limitador de roedores (ver vídeo) e fechando a extremidade aberta do tubo delicadamente pressionando o êmbolo. Não deixe de ir a cauda do rato durante este processo, como alguns animais de pequeno porte pode virar-se dentro do limitador. Este método evita que o animal de ferir-se e de mover-se durante a injecção. Ao configurar o limitador de roedores, não empurre o êmbolo para dentro mais longe do que é necessário para manter o animal de saltar para a frente. Além disso, não empurre o êmbolo contra o animal, e não deixar o animal no limitador por um período prolongado de tempo. c. Visualização da veia da cauda Puxe o rabo em sua direção para que seja levemente enrolado ao longo do seu dedo indicador e segurou contra o interior do dedo pelo seu polegar. Identificar as veias da cauda localizados em cada lado da cauda na posição vertical. A visualização é facilitada pelo aquecimento da cauda com água morna, em seguida, limpar-se com etanol. d. Injeção de células Quando a veia foi localizada, insira a seringa bisel voltado para cima em um ângulo paralelo rasa para a veia. Uma vez na veia, gentilmente o êmbolo, se você está na veia não deve haver nenhuma resistência à injeção. Se houver resistência, retire a seringa e tente novamente em um local diferente. Se você está na veia, lentamente o êmbolo até que a injeção é completa. A cauda não deve tornar-se distendido durante a injecção. Se isso acontecer, isso significaria que a agulha não está na veia. É possível &quot;perder&quot; a veia durante a injeção. Se isso acontecer, retire a agulha e tentar a sua injeção em um local diferente. Se você precisa tentar mais de uma injeção, o melhor é mover a cauda para cima em direção ao corpo do mouse a partir do local da injeção original. Planejar com antecedência para essa possibilidade, iniciando distalmente na cauda para dar-se espaço para mais uma tentativa de transferência adotiva. e. Pós-injeção considerações Após a injeção for concluída, um pequeno refluxo de sangue da veia irá ocorrer. Pressione suavemente o local da injecção com um limpa-wipe até parar de sangrar. Retire o êmbolo e deixe o animal andar para a frente, fora do limitador, enquanto delicadamente segurando a cauda. Sempre verifique com seu comitê de cuidados com animais e protocolos de uso de animais para garantir que está em conformidade. É importante praticar esta técnica várias vezes antes de tentar a experiência real. 2. Isolamento do Linfonodo Isolamento dos gânglios linfáticos por dois fótons de imagem requer a remoção cuidadosa do linfonodo correta do tecido circundante. a. Seleção e localização de linfonodos periféricos Seleção de linfonodos para imagens vai depender dos objetivos experimentais. Estar ciente de infecção local ou injeção de drenagem dos gânglios linfáticos, e selecione o nó apropriado para imagens. O artigo de Van den Broeck et al., Descreve a localização e morfologia dos gânglios linfáticos murino em detalhe 3. Neste vídeo, demonstramos a excisão de seis grandes linfonodos periféricos, que são adequados para o isolamento de células ou de imagem. b. Remoção dos linfonodos: Tenha em mente a integridade do tecido durante a remoção dos gânglios linfáticos. Tenha cuidado para não romper a cápsula ou em qualquer forma prejudicar a estrutura dos linfonodos. Perda da integridade estrutural de linfonodo irá comprometer o experimento. Se necessário, remover a gordura da superfície linfonodo com finas pinças de dissecação (# 5 Dumont) sob um microscópio de dissecação. Linfonodos não deveria ter qualquer gordura restante na superfície do nó, pois isso irá obscura de imagem por espalhamento da luz. Excisão adequada de linfonodos também é uma técnica importante para a prática antes da primeira experiência real. 3. Nod linfáticose de imagem de instalação e Considerações Linfonodo deve ser assegurada para a fase de imagem, que neste caso consiste em uma câmara embutida. Aquecido, de oxigênio perfundidos mídia é bombeado para a câmara de um lado através de uma bomba peristáltica e aquecedor de inline, e ele sai através de um canal de queda-graduada em uma câmara de coleta com um tubo de vácuo para um balão de recolha de resíduos. No nosso sistema, o linfonodo está submerso em 37 ° C media e super-perfundidos com classe médica carbogênio (5% CO 2, 95% O 2). A temperatura do meio de perfusão deve ser registrada como perto do nó de linfa como é possível. Seu sistema em particular pode exigir variações na taxa de fluxo de mídia e cenografia para acomodar o estágio do microscópio e objetiva. a. Linfáticos configuração de imagem nó: Conforme mostrado no vídeo, que segura o linfonodo pelo primeiro anexá-lo, medular voltada para baixo (para a imagem de T ou células B zonas usando um microscópio vertical) para uma lamela de plástico, cortado no tamanho apropriado. É importante usar uma cola de tecido não-tóxico (usamos VetBond ™ da 3M Corporation). A lamela é garantido na mídia que flui, colocando uma pequena bagatela de graxa de silicone na parte de baixo da lamínula, em seguida, aderir à essa base de vidro da câmara de imagem. b. 2-Photon considerações de imagem: Vários fatores podem causar linfócitos parar de se mover: temperatura muito alta ou muito baixa; potência do laser em excesso; compressão ou outros danos ao nó de linfa, e falta de oxigênio. Danos devido a potência do laser excessiva ou temperaturas&gt; ~ 39 ° C é irreversível. Se as células são fracas, é tipicamente melhor para aumentar o ganho de detector ou o protocolo de células-rotulagem em vez de usar um poder maior de laser para visualizar as células. Otimização de rotulagem ou expressão de proteínas fluorescentes pode ser necessária para trazer a fluorescência acima do nível de autofluorescência de fundo. Com ganho razoável e configurações de energia do laser, uma mudança dois log de fluorescência acima dos valores basais (medido por citometria de fluxo) é razoável para a visualização de células. Sintonizável com dois fótons lasers, o comprimento de onda usado para a excitação deve ser um pouco inferior ao dobro do máximo de excitação o fóton único do fluoróforo sendo fotografada. Em dois fótons experimentos usando mais de um rótulo ou proteína fluorescente pode ser necessário fazer experiências com o comprimento de onda de excitação usada para encontrar os melhores ajustes para ambos os rótulos. Excitação de dois fótons também pode ser usado para estruturas de colágeno endógeno imagem, aproveitando o intrínseco de segunda geração azul harmônica. Geração de segundo harmônico (SHG) ocorre quando dois fótons são combinados dentro de um material e emitir um único fóton de duas vezes a freqüência dos fótons original. Em tecido, de dois fótons de excitação ocorre quando a luz do laser incidente é perpendicular a uma estrutura de proteínas altamente ordenada como o colágeno. Questões práticas a respeito de dois fótons de imagem foram discutidas nas revisões preview 4, 5.

<ol>
	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

Neste protocolo de vídeo que mostram os procedimentos para a transferência de células adotivos e isolamento de linfonodo e preparativos necessários para a imagem da motilidade de linfócitos em um linfonodo periférico. Dois fótons de imagem tem várias vantagens sobre imagem confocal em ambos os tecidos explantado (mostrado aqui) e em preparações intravital. Notavelmente, a utilização de infra-vermelho de excitação minimiza espalhamento de luz e permite uma imagem a 300 micrômetros abaixo da cápsula do linfonodo e mais profundo em cerca de 4 tecidos. Além disso, multi-fotão excitação é restrito ao ponto focal da objetiva, minimizando foto branqueamento e dano tecidual lado de fora do plano focal. Como acontece com qualquer nova técnica, no entanto, dois fótons de imagem não é uma panacéia e suas limitações e perigos potenciais devem ser mantidos em mente 5. Entre elas está a exigência de que - excetuando sinais intrínsecos, como geração de segundo harmônico por colágeno, células de interesse devem ser rotulados por sondas fluorescentes extrínseco ou pela expressão de proteínas fluorescentes. A impressão é assim criado que estas células marcadas estão nadando em um vazio negro e que na verdade eles estão imersos em e interagir com um ambiente complexo de elementos estruturais e uma miríade de outros sem rótulo, as células invisíveis. Nos seis anos desde a introdução de dois fótons de imagem para imunologia, esta técnica tem permitido aos pesquisadores endereço de longa data perguntas a visualização direta em tecidos vivos intactos, incluindo processos de interações célula-célula, motilidade celular e localização, vias de sinalização celular e de células citotóxicas matando eventos. O campo tem evoluído rapidamente para além inicial descrições fenomenológicas, e análises quantitativas em conjunto com modelagem e simulação computacional estão começando agora a fazer sentido como os movimentos aparentemente caótica celular e interações dentro dos gânglios linfáticos levar a uma resposta imune eficiente. Este progresso é totalmente revisto em uma publicação recente 1, que lista mais de 100 artigos descrevendo a aplicação de dois fótons de microscopia para immunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

Dois fótons de imagens revelou uma coreografia elegante da motilidade e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e no início de uma resposta imune 1. Aqui, apresentamos métodos para transferência adotiva de células T rotulados, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado como descrita pela primeira vez em 2002 2. Imagem de dois fótons de células do sistema imunológico requer que as células são fluorescente etiquetado, seja através da coloração com um corante rastreador celular ou por expressar uma proteína fluorescente. Nós demonstramos o procedimento de transferência adotiva de células derivadas de camundongos injetando doador na veia da cauda, ​​onde o lar de órgãos linfóides dentro de aproximadamente 15-30 min. Destinatário de um animal Ilustramos o isolamento de um nó de linfa e descrever métodos para garantir uma montagem adequada do linfonodo extirpado. Outras considerações, tais como a oxigenação adequada dos meios de comunicação perfundidos, temperatura e potência do laser são discutidas. Finalmente, apresentamos as imagens de vídeo 3D de CD4 + células T ingênuo exibindo motilidade estado de equilíbrio a 37 ° C.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice at JoVE.com

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

46.1K visualizações.  University of California, Irvine (UCI).  Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune 1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado. 

Vídeo: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagem Funcional de gordura marrom em ratos com FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissecção da Auditivo Bulla em ratos pós-natais: Isolamento dos ossos do ouvido médio e da análise histológica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...