Esta pesquisa pode ajudar a responder a quaisquer perguntas neles na contagem de bioquímicos e no campo da metodologia, como a análise dos direitos de desenvolvimento no nematoide. A principal vantagem dessa técnica é a precipitação proteica na extradução e bebida e homogeneização dos vermes. Inicie este experimento cultivando a cepa E.coli OP50 em 300 mililitros de caldo LB médio líquido a 37 graus Celsius durante a noite.
Armazene op50 bem sucedido a quatro graus Celsius. Pipeta dois mililitros do op50 cultivado no mínimo três NGM previamente preparado, ou Placas de Agar de Mídia de Crescimento Nematode e espalhados à mão girando a placa. Incubar as placas à temperatura ambiente durante a noite para criar uma fina camada de OP50.
Em seguida, use um palito estéril para escolher um pedaço de ágar de uma placa com vermes, para adicionar pelo menos 100 worms a cada placa OP50 NGM. Cultura pelo menos três placas com os vermes a 20 graus Celsius, até que os vermes cheguem ao estágio adulto, o que é confirmado sob microscópio estereoscópico. Localize hermafroditas gravid cheias de ovos usando um microscópio estereoscópico.
Depois de adicionar cinco mililitros de tampão S às placas, use a pipeta Pasteur para transferir os vermes das três placas para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os vermes três vezes adicionando 15 mililitros de S-buffer e, em seguida, centrifugando a 300 vezes G à temperatura ambiente por 30 segundos. Se o volume de tampão S exceder cinco mililitros, remova o excesso de buffer após a centrifugação.
Para exonização bem sucedida e isolamento de ovos a granel, dissolva os vermes em 0,5 mililitros de solução alcalina de hipo clorato. Misture invertendo e incubando à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Centrifugar a 1.400 RPM por 30 segundos para remover a solução.
Use 15 mililitros de tampão-S para lavar a pelota de ovo. Depois de centrifuá-lo remova o supernasce e repita esta lavagem pelo menos três vezes. Após a última lavagem, suspendemos a pelota em cinco a seis mililitros de S-buffer, sem E.coli e incubamos os ovos durante a noite a 20 graus Celsius para eclodi-los e alcançar a cultura síncrona H de larvas de estágio L1.
Pipeta 10 microliters de S-buffer contendo worms L1 em três deslizamentos de tampa. Conte as larvas sob um microscópio estereoscópico e calcule a média para determinar o número aproximado de larvas do estágio L1. Finalmente, transfira as larvas do estágio L1 para cinco placas de NGM Agar com OP50 e plante-as a 20 graus Celsius até a fase adulta jovem, durante a qual ocorre a auto-fertilização e alguns ovos são colocados.
Observe os vermes todos os dias sob o microscópio e, em seguida, colete o jovem adulto, ou vermes de cinco dias de idade. Para selecionar apenas vermes vivos, adicione os vermes suspensos em três a quatro mililitros de tampão-S a um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione um volume igual de sacarose gelada de 60% e misture.
Centrifugar o tubo a 1.500 vezes G a 4 graus Celsius por 15 segundos. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para mover cuidadosamente os vermes da parede do tubo, e, em seguida, remover os vermes flutuantes em um tubo fresco. Encha o tubo com tampão S para lavar os vermes, e centrífuga a 1500 vezes G a quatro graus Celsius por 30 segundos.
Retire o buffer e repita a lavagem mais duas vezes. Após a terceira lavagem, remova cuidadosamente o supernascer, certificando-se de não remover nenhum verme, e use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter para medir o volume úmido dos vermes lavados. Para precipitação proteica, use uma pipeta Pasteur para adicionar os vermes lavados a um volume igual de ácido 10% tricloroacético em um homogeneizador colocado no gelo.
Homogeneize usando 40 traçados de passel com rotação, até 1.300 RPM. Use um homogeneizador ultrassônico com ciclo de 20% de dever para sonicar o homogeneizado. Use uma pipeta Pasteur para transferir o tubo homogeneado para 1,5 mililitro colocado no gelo.
Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de micro centrífuga, centrífuga a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos para esclarecê-lo. Transfira o supernante para um tubo fresco e adicione quatro cloreto de potássio molar e incubar no gelo por 20 minutos para neutralizá-lo. Em seguida, centrifuá-lo a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Transfira o supernante para um tubo fresco e armazene a 80 graus Celsius até que seja necessário para mais ensaios. Para medir a concentração de lactato, utilize um kit de ensaio colorimétrico para realizar análises duplicadas para as amostras de ensaio. Adicione 10 microliters das amostras de ensaio a cada poço de uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione o tampão de ensaio de lactato a cada amostra para ajustar o volume a 15 microliters.
Diluir 100 milimólares L+Lactato Padrão com tampão de ensaio de lactato para um milimiliar. Em seguida, em uma série de poços, adicione zero, dois, quatro, seis, oito e 10 microliters de L+Lactate Standard diluído. Adicione 50 microliters de mistura de reação a cada poço, e incubar à temperatura ambiente protegido da luz por pelo menos 30 minutos para que a cor se desenvolva.
Por fim, use um leitor de microplacão para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Subtraia a absorvância da mistura de controle de fundo a partir da absorvância da mistura de reação. Em seguida, plote a curva padrão de lactato e calcule as concentrações de lactato da curva multiplicando cada concentração por 2,25.
Use um kit de ensaio colorimétrico para medir a concentração de piruvato nas amostras de teste e realize exames duplex. Adicione 10 microliters das amostras de teste a diferentes poços de uma placa de 96 poços, e adicione 90 microliters de reagente de trabalho a cada amostra. Incubar coberto por 30 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, coloque a placa no leitor de microplacões para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Plote a curva padrão do piruvato e calcule as concentrações do piruvato a partir da curva padrão multiplicando cada concentração por 2,25. E, finalmente, para medir a concentração de proteína nas amostras de teste, use um kit de ensaio colorimétrico conforme descrito no protocolo de texto.
Após a precipitação proteica, os ensaios colorimétricos podem ser usados para a determinação quantitativa das concentrações de lactato e piruvato. Este experimento mostra a precisão dos ensaios colorimétricos contrários aos relatórios anteriores em C.Elegans. Além disso, esses ensaios são suficientemente sensíveis para medir concentrações de lactato e piruvato, mesmo em amostras de pequena escala em um curto período de tempo.
Para detectar com precisão lactato e piruvato em C.elegans, é crucial realizar precipitação proteica durante a homogeneização dos vermes. A quantidade de lactato e piruvato detectados é maior quando as amostras são progaméticas precipitadas durante a homogeneização, em comparação com a fração citosolica intacta ou após a homogeneização quando não havia lactato ou piruvato detectado.
