この研究は、線虫の開発権の分析など、生化学数および方法論分野の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ワームの外挿および飲料および均質化におけるタンパク質沈殿である。一晩で37°CでLBスープ液体培地の300ミリリットルで大腸菌OP50株を成長させることによって、この実験を開始します。
成功したOP50を摂氏4度で保管してください。培養OP50のピペット2ミリリットルは、少なくとも3つの前に調製されたNGM、またはネマトード成長培地寒天プレートに、プレートを手で旋回して広がる。プレートを室温で一晩インキュベートし、OP50の薄い層を作り出します。
次に、無菌爪楊枝を使用して、ワームを含むプレートから寒天の一部を選び、各OP50 NGMプレートに少なくとも100個のワームを追加します。ワームが成虫段階に達するまで、少なくとも3つのプレートを摂氏20度で培養し、立体顕微鏡で確認する。立体顕微鏡を使用して卵で満たされたグラヴィッド雌雄同体を見つけます。
5ミリリットルのSバッファーをプレートに加えた後、パスツールピペットを使用して、3つのプレートすべてから15ミリリットルの円錐形チューブにワームを移します。15ミリリットルのSバッファを加え、室温で300倍Gで遠心分離機を30秒間加えて、ワームを3回洗います。Sバッファーの体積が5ミリリットルを超える場合は、遠心分離後の余分なバッファーを除去します。
正常なエキソニゼーションとバルク卵の分離のために、0.5ミリリットルのアルカリ性低塩素酸溶液にワームを溶解します。室温で10~15分間、反転してインキュベートします。遠心分離機を1,400RPMで30秒間、溶液を除去した。
卵ペレットを洗浄するためにSバッファーの15ミリリットルを使用してください。遠心分離後、上清を取り除き、この洗浄を少なくとも3回繰り返します。最後の洗浄後、大腸菌なしで5〜6ミリリットルのSバッファにペレットを吊り下げ、卵を20°Cで一晩インキュベートして孵化させ、L1ステージ幼虫のH同期培養を達成します。
3つのカバースリップにL1ワームを含むSバッファーのピペット10マイクロリットル。立体顕微鏡で幼虫を数え、平均を計算してL1ステージ幼虫のおおよその数を求める。最後に、L1ステージの幼虫をOP50で5つのNGM寒天プレートに移し、若い成人期まで摂氏20度で成長させ、その間に自己受精が起こり、卵が数個産まれる。
顕微鏡の下で毎日ワームを観察し、その後、若い成虫、または5日齢のワームを収集します。生きているワームのみを選択するには、Sバッファの3〜4ミリリットルに吊り下げられたワームを15ミリリットルの円錐形チューブに加えます。その後、氷冷60%スクロースの等量を追加し、ミックス。
チューブを摂氏4度で1、500倍Gで15秒間遠心する。その後、パスツールピペットを使用して慎重にチューブの壁からワームを移動し、新鮮なチューブに浮遊ワームを除去します。チューブにSバッファを充填してワームを洗浄し、遠心分離機を摂氏4度で1500倍に30秒間充填します。
バッファーを取り外し、さらに2回洗浄を繰り返します。3回目の洗浄後、上清を慎重に除去し、ワームを除去しないようにし、洗浄されたワームの湿潤体積を測定するために1,000マイクロリットルピペットチップを使用します。タンパク質沈殿の場合は、パスツールピペットを使用して、洗浄されたワームを氷の上に置かれたホモジナイザーの氷冷10%トリクロロ酢酸の等量に加えます。
回転で40ストロークのパッセルを使用して均質化し、最大1,300 RPM。ホモジネートを超音波処理するために20%デューティサイクルで超音波ホモジナイザーを使用してください。パスツールピペットを使用して、ホモジネートを氷の上に置かれた1.5ミリリットルのチューブに移します。
ホモジネートをマイクロ遠心管に移した後、それを明確にするために摂氏4度で8,000時間Gの遠心分離機を10分間分とした。上清を新鮮なチューブに移し、4つの塩化カリウムを加え、氷の上で20分間インキュベートして中和します。その後、摂氏4度で8,000倍Gで10分間遠心分離します。
上清を新鮮なチューブに移し、さらにアッセイが必要になるまで摂氏80度で保管します。乳酸塩の濃度を測定するには、測色測定キットを使用して、試験サンプルの重複分析を行います。96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルの試験サンプルを加え、各サンプルに乳酸アッセイバッファーを加えて、体積を15マイクロリットルに調整します。
乳酸アッセイバッファーを1ミリモルに100ミリモルL+乳酸塩標準で希釈します。次に、一連のウェルに、希釈されたL +乳酸塩標準のゼロ、2、4、6、8、および10マイクロリットルを加えます。各ウェルに50マイクロリットルの反応ミックスを加え、光から保護された室温で少なくとも30分間インキュベートして色が現れます。
最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、570ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。反応ミックスの吸光度からバックグラウンドコントロールミックスの吸光度を差し引きます。次に乳酸塩標準曲線をプロットし、各濃度に2.25を掛けて曲線から乳酸塩濃度を計算します。
着色測定アッセイキットを使用して、試験サンプル中のピルビン酸濃度を測定し、二重検査を実施します。96ウェルプレートの異なる井戸に10マイクロリットルの試験サンプルを加え、各サンプルに90マイクロリットルの作業試薬を加えます。室温で30分間包むインキュベート。
その後、プレートをマイクロプレートリーダーに入れ、570ナノメートルで各ウェルの吸収性を測定します。ピルビン酸標準曲線をプロットし、各濃度に2.25を掛けて標準曲線からピルビン酸濃度を計算します。そして最後に、試験サンプル中のタンパク質濃度を測定するために、テキストプロトコルに記載されているように、色分けアッセイキットを用いる。
タンパク質沈殿後、乳酸およびピルビン酸濃度の定量的測定に対して、着色アッセイを用いることができる。この実験は、C.Elegansの以前の報告に反する比色アッセイの精度を示しています。さらに、これらのアッセイは、短期間で少量サンプル中でも乳酸塩およびピルビン酸濃度を測定するのに十分に敏感である。
C.elegansで乳酸およびピルビン酸塩を正確に検出するには、ワームの均質化中にタンパク質沈殿を行うことが重要です。乳酸塩およびピルビン酸の検出量は、サンプルが均質化中にタンパク質沈殿した場合、乳酸塩またはピルビン酸がまったく検出されなかった場合に均一化した後の無傷の細胞質分画と比較して高くなります。
