Gostaríamos de agradecer aos Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e Sra. Ximena Optiz-Araya para assistência inicial com configuração do protocolo e para fornecer plasmídeos. Este trabalho foi suportado pela concessão NIH / NIDCD DC013841 (JTS).

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Northwestern e realizados de acordo com as Diretrizes de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Manuseio de ovos <ol><li> Compre ovos fertilizados de um fornecedor local. Armazene os ovos a 13 ° C na geladeira por não mais de 5 dias antes da incubação. A viabilidade do embrião diminui significativamente após 1 semana. </li><li> Espume cada ovo com etanol a 70% antes de se estabelecer na incubadora. </li><li> Configure 1-2 dúzias de ovos em seus lados em uma incubadora com a temperatura ajustada para 38 ° C a ~ 50% de umidade. Isso garante o posicionamento adequado do embrião para eletroporação e viabilidade ideal, respectivamente. NOTA: Após 48-52 h de incubação, os ovos estarão no estágio Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 e pronto para eletroporação. </li></ol> 2. Preparação <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Adicione 1 μL de 0,1% de verde rápido (0,1% em 18 MΩ desionado e H 2 O destilado [ddH 2 O]) por cada 7 μL de mistura de DNA. </li><li> Para co-electroporação de plasmídeos múltiplos, misture plasmídeos em proporção 1: 1. A concentração final de DNA deve ser 5-8 μg / μL. </li></ol></li><li> Pipeta de injeção de preenchimento <ol><li> Puxe pipetas em um extractor de micropipetas. Encha a pipeta com 1-2 μL de plasmídeos usando uma agulha de seringa 28G. </li><li> Deslize a ponta da pipeta para 10 a 20 μm usando fórceps. Use um microscópio para ajudar a determinar o tamanho da ponta de pipeta quebrada. Anexe a pipeta ao titular da pipeta do picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Windowing NOTA: O procedimento de janelas foi publicado antes de 13 . Consulte a referência 13 para obter informações visuais adicionais. <ol><li> Limpe todos os instrumentos e a área de trabalho com 70%etanol. </li><li> Pegue o número desejado de ovos estabelecidos para fora da incubadora (entre 6-10), deixe à temperatura ambiente e colete ovos com 70% de etanol novamente. Os ovos permanecem viáveis ​​por pelo menos 2 h após a remoção da incubadora. </li><li> Coloque o ovo em cima de um iluminador leve para identificar o posicionamento do embrião. Circule o centro da área escura ( ou seja , embrião) com um lápis. </li><li> Usando uma agulha 19G, puxa um buraco na extremidade contundente do ovo. </li><li> Puxar outro buraco perto do círculo desenhado no lado aguçado do ovo. Remova um pequeno pedaço da casca de ovo exterior (cerca de 16 mm 2 ) com a agulha 19G e, em seguida, remova uma pequena peça da casca de ovo interior (cerca de 8 mm 2 ) com fórceps. </li><li> Com uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha 19G, retire 1,5-2,5 mL de albumina do ovo através do buraco sem corte. Certifique-se de inclinar a agulha para baixo a 45 °. </li><li> Cubra o orifício sem corte com um pequeno pedaço de fita (1 cm x 1 cm). Cubra o círculo desenhado eD o segundo furo com fita adesiva (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Com tesoura curvada (corte = 2,5 cm), corte uma janela dentro do círculo. As tesouras devem ser paralelas à casca do ovo e o diâmetro da janela deve ser inferior a 2 cm. </li></ol> 4. Injeção de plasmídeo <ol><li> Ligue o picospritzer. Ajuste a pressão para 18 psi e a duração para 5 μs. Ligue o tanque de ar e a lâmpada para o microscópio de dissecação. </li><li> Faça uma solução de reserva de 30 mL de uma diluição 1:10 de tinta indiana comprada na loja misturada com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Armazenar a 4 ° C. A injeção de tinta indiana é um passo importante para obter uma melhor visualização do embrião de frango. <ol><li> Encha uma seringa de 1 mL com a solução diluída de tinta indiana. Anexe uma agulha 27G e expulse as bolhas que estão presentes na seringa. </li><li> Insira a agulha logo abaixo da membrana da gema ~ 2 - 3 mm do embrião e injete suavemente 0,2 mL de tinta indiana sob o embrião. FazNão injetar mais de 0,5 mL da tinta indiana, pois pode diminuir a sobrevivência do embrião. </li></ol></li><li> Coloque o ovo com janelas em um suporte de ovo sob o microscópio de dissecação. Use a maior ampliação para melhor visualização do local de injeção de plasmídeo. </li><li> Usando fórceps, remova a membrana sobre a área de injeção. Regiões auditivas de tronco encefálico de interesse ( ou seja , NM e NL) surgem de Rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 estão localizados adjacentes aos otocistos (uma estrutura embrionária em vertebrados que se desenvolve na orelha interna) que servem como marcos para injeções plasmáticas R5 / R6. </li><li> Abaixe a pipeta cheia de DNA no tubo neural que cobre a região R5 / R6 e entre otocistos usando o micromanipulador. Um esquema da colocação ideal é mostrado na Figura 1A . </li><li> Aplique pressão de ar (18 psi, 5 μs de duração) do picospritzer para expulsar o DNA no tubo neural. </li></ol> 5. Electroporação <ol><li> Ativar tO estimulador de corrente / tensão. </li><li> Encha uma seringa de 3 mL com PBS e prenda o filtro da seringa. Adicione 1-2 gotas de PBS no embrião. </li><li> Abaixe o eletrodo bipolar para o embrião usando o micromanipulador com o eletrodo negativo acima do local da injeção (medial) e o eletrodo positivo lateral ao R5 / R6 ( Figura 1A ). Evite o contato direto com o embrião. Use eletrodos bipolares onde o material do eletrodo é iridio de platina. Ajuste o espaçamento entre as pontas para 0,5 mm com fórceps. </li><li> Usando um estimulador de corrente / tensão, pulso 20 vezes a 50 V por 1 ms a intervalos de 1 s. </li><li> Após a eletroporação, adicione uma gota de PBS sobre a área exposta. Remova cuidadosamente o eletrodo e limpe-o com um tecido de laboratório e 70% de etanol. Feche a janela expondo o embrião com fita adesiva. </li><li> Marque a casca de ovo com o tipo de plasmídeo injetado e a data da escotilha. </li><li> Coloque os ovos de volta na incubadora com a janela voltada para cima. Incube a 38 ° C com 50% De umidade até atingir o estágio de desenvolvimento desejado. </li><li> Se um vetor tet-on é eletroporizado para o controle temporal da expressão gênica, aplique Doxiciclina (Dox) a cada 24 h para induzir a expressão gênica (ver Seção 6). </li></ol> 6. Sistema Tet-on para Controle Temporal de Expressão Genética <ol><li> Use os seguintes plasmídeos: PCAGGS-T2TP: um plasmídeo que expressa transposase. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: um plasmídeo que expressa de forma estável a proteína de ligação de Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: um plasmídeo que contém uma expressão de promotor tet-on bidirecional bidireccional (TRE) do repórter EGFP e um segundo gene de interesse. NOTA: Os três plasmídeos acima mencionados precisam ser co-electroporados em uma proporção de 1: 1: 1. </li><li> Preparação da solução de estoque: <ol><li> Dissolver Dox em PBS estéril para produzir uma solução de reserva de 1 mg / mL. Armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Aplicação Dox: <ol><li> Para induzir o expressioN do gene de interesse durante certos estágios de desenvolvimento, aplique Dox a cada 24 h. </li><li> Ao aplicar o Dox, retire o ovo, abra a janela, pipette 50 μL de Dox na membrana corioalointoica, feche a janela e coloque o ovo novamente na incubadora. </li></ol></li></ol> 7. Preparação da área de dissecação para fatias do tronco encefálico NOTA: As seguintes seções (7-9) e procedimentos foram publicados antes de 14 . Veja essas referências para obter informações visuais adicionais. <ol><li> Prepare uma solução de ágar (40 mg / mL de agarose, ou seja , 4% em ddH 2 O). Despeje a solução de ágar numa placa de Petri e deixe-a solidificar à temperatura ambiente. Armazene a placa de ágar coberta na geladeira para uso futuro durante o corte de tecido do tronco encefálico. </li><li> Fluido espinhal cerebral artificial contínuo (ACSF) com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,2-7,4 e osmolaridade: 295-310 mOsm / L).</li><li> Limpe a área de trabalho e vibratome com 70% de EtOH e enxágue a lâmina com água destilada. </li><li> Coloque uma almofada de absorção de fluido limpa na área de trabalho com ferramentas de dissecação adequadas. </li><li> Retire a placa de ágar da geladeira, corte um pequeno cubo de ágar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Cola o bloco de agar até o estágio de uma câmara de corte de vibratoma usando superglue comercialmente disponível. </li></ol> 8. Isolamento do Brainstem Auditivo de Frango <ol><li> Abra o ovo no local da janela gravada. Puncione o saco de membrana com um bisturi e remova a cabeça do embrião de frango. </li><li> Decapite o frango com tesoura afiada. </li><li> Coloque a ponta da lâmina de barbear ligeiramente posterior aos olhos. Incise através do crânio na linha média rostral-caudal. Aplique uma ligeira pressão dependendo da idade do embrião. Os embriões mais antigos exigem mais pressão. </li><li> Empurre suavemente a pele e as penas para expor o crânio e verificar o corte da linha média. </li><li> Aplicando sTrong pressure, corte a porção rostral do crânio com uma lâmina de barbear. Coloque imediatamente a lâmina posterior aos olhos e corte todo o tecido do crânio e do cérebro. </li><li> Faça incisões de linha a lateral com tesouras na região caudal do crânio, ligeiramente anterior aos músculos do pescoço em ambos os lados da cabeça. Exponha cérebro e cerebelo puxando o crânio e o excesso de tecido. </li><li> Corte o tecido ligado ao tronco cerebral com uma tesoura e remova o tronco encefálico, que se desprende livremente do crânio. </li></ol> 9. Preparação de fatias de tronco encefálico para eletrofisiologia ou imagem in vivo <ol><li> Desligue o tronco cerebral através da tela óptica. </li><li> Retire o cerebelo cortando pedúnculos com tesoura, expondo o piso do quarto ventrículo. </li><li> Usando pinças, remova qualquer tecido membranoso e vasos sanguíneos da superfície do tronco encefálico. </li><li> Para bloquear o tronco encefálico, faça um corte horizontal na extremidade mais rostral do chão dos quatroVentrículo, apenas caudal ao córtex. Faça cortes laterais perpendiculares através da tela óptica para isolar o tronco encefálico. </li><li> Coloque uma pequena quantidade de super cola na fase de vibração diretamente na frente do bloco de ágar. </li><li> Levante o tronco encefálico na medula espinhal usando pinças e coloque-o na super cola com o lado rostral para baixo e o lado dorsal em direção à pá vibratoma. Remova o excesso de cola com um papel de laboratório ou papel de filtro. </li><li> Despeje a ACSF oxigenada no estágio de vibração. Coloque a lâmina vibratoma em um ângulo de 20-22 °. Comece vibratome na oscilação de amplitude máxima. Mova o andar em direção à lâmina para que a parte superior do tecido seja paralela à lâmina. </li><li> Mova rapidamente a lâmina para o tecido do tronco encefálico. Deslize a lâmina lentamente antes do contato da lâmina com o tecido. </li><li> Corte o tecido com a velocidade de avanço mais lenta possível. Uma vez que a lâmina atravessa toda a seção de tecido coronal, remova suavemente a fatia usando uma pipeta de transferência. &lt;/ Li&gt; <li> Abaixe o palco 200-300 μm e faite novamente. Repita até que os marcos anatômicos dos núcleos auditivos se tornem visíveis, por exemplo, a região distinta de neuropil dorsal / ventral de NL e a localização medial do NM em relação à NL. </li><li> Mantenha cuidadosamente as fatias no ACFS. Isso pode ser feito a temperatura ambiente (22 ° C) ou perto de condições fisiológicas (~ 41 ° C) usando um banho de água quente. Observe a ordem de cortar. A primeira fatia corresponde à região mais caudal do tecido e a última fatia corresponde à região mais rostral. Isso representa grosseiramente a organização tonotópica do tronco auditivo auditivo, de regiões de codificação de baixa a alta freqüência, respectivamente. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A electroporação in ovo é um método para expressar ou derrubar genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . No embrião de frango, é um método inovador para expressar genes codificados por plasmídeos em diferentes regiões do tronco encefálico 8 . Para garantir a expressão ideal, são necessárias várias etapas críticas. Em primeiro lugar, apenas injete embriões cujos otocisto...

A codificação neural rápida do som é essencial para funções auditivas normais. Estas incluem habilidades de localização de som 1 , fala na discriminação de ruído 2 e a compreensão de outros sinais de comunicação relevantes ao comportamento 3 . Os neurônios análogos localizados no tronco encefálico auditivo de aves e mamíferos são altamente especializados para codificação neural rápida 4 . Estes incluem o núcleo de galinha magnocellular (NM), o núcleo laminaris (NL) e seus análogos de mamíferos, o núcleo coclear anteroventral (AVCN) e a azeitona mediana superior (MSO), respectivamente 5 . No entanto, os mecanismos de desenvolvimento que regulam a codificação neural rápida são mal compreendidos no tronco encefálico auditivo. Portanto, é vantajoso estudar genes específicos que são responsáveis ​​pela codificação neural rápida, a fim de melhor compreender a sua expressão, regulação e função no auDesenvolvimento de distritos. O embrião de frango em desenvolvimento é uma ferramenta de pesquisa eficaz e bem estabelecida para estudar questões biológicas básicas de desenvolvimento do sistema auditivo 6 , 7 . Avanços moleculares recentes abordaram essas questões biológicas no embrião de frango em desenvolvimento, expressando ou derrubando genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . Investigar o papel regulador de genes específicos é um avanço significativo na compreensão de patologias associadas aos déficits auditivos. Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos no tronco encefálico de frango onde ocorre uma rápida codificação neural de som 10 . Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com os fômulos 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostramos o controle espacial da transfecção do plasmídeo em NM e NL. Além disso, mostramos a regulação temporal da expressão adotando um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

A eletroporação é um método que introduz genes de interesse em organismos biologicamente relevantes como o embrião de frango. Está estabelecido há muito tempo que o embrião de frango é um modelo de pesquisa eficaz para estudar as funções biológicas básicas do desenvolvimento do sistema auditivo. Mais recentemente, o embrião de frango tornou-se particularmente valioso no estudo da expressão gênica, regulação e função associada à audição. A eletroporação no ovo pode ser usada para direcionar as regiões auditivas do tronco encefálico responsáveis ​​por funções auditivas altamente especializadas. Estas regiões incluem o núcleo de galinha magnocellularis (NM) e o núcleo laminaris (NL). Os neurônios NM e NL surgem de precursores distintos de rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos para estudar propriedades relacionadas a genes nessas regiões. Mostramos um método para o controle espacial e temporal da expressão gênica que promove o ganho ou a perda de fenótipo funcionalEs. Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com R5 / R6, mostramos transfecção plasmídica em NM e NL. A regulação temporal da expressão gênica pode ser conseguida através da adoção de um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox). A técnica de eletroporação in ovo - juntamente com ensaios funcionais bioquímicos, farmacológicos e in vivo - fornece uma abordagem inovadora para estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos fisiopatológicos associados.

Mostramos aqui que em ovo a eletroporação permite a expressão gênica em um sistema biológico normalmente desenvolvido. Os genes codificados por plasmídeo são injetados focalmente no tubo neural que cobre R5 / R6. Um exemplo esquemático das colocações de eletrodo e pipeta em relação aos marcadores anatômicos importantes é mostrado na Figura 1A . A localização correta da injeção do plasmídeo é confirmada 24 h após a eletroporação e mostrada ...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K visualizações.  Northwestern University.  Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo. 

Vídeo: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

Preparação e Cultura do Fatias de frango auditivo de tronco cerebral

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Neurociência

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Biologia do Desenvolvimento

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

Fatiando o tronco auditivo de frango embrionário para avaliar gradientes tonotópicos e microcircuitos

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Avaliação da Resposta Auditiva do Brainstem em Filhotes de Frango

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Resumo

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