우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다. 1. 계란 취급 <ol><li> 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다. </li><li> 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오. </li><li> ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다. 참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다. </li></ol> 2. 준비 <ol><li> 플라스미드 Mi싱 <ol><li> DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2 O [ddH 2 O] 0.1 %)를 첨가하십시오. </li><li> 여러 플라스미드의 공동 electroporation, 1 : 1 비율로 플라스미드를 섞는다. 최종 DNA 농도는 5-8 μg / μL이어야합니다. </li></ol></li><li> 필 주입 피펫 <ol><li> micropipette 끌어 당기는 사람에 pipettes를 당겨. 28G 주사기 바늘을 사용하여 1-2 μL 플라스미드로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 포 셉을 사용하여 10 - 20 μm의 피펫 팁을 끊으십시오. 깨진 피펫 팁의 크기를 결정하는 데 도움이 현미경을 사용하십시오. 피코 스피 쳐의 피펫 홀더에 피펫을 부착하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 윈도우 잉 참고 : 윈도우 절차는 13 전에 게시되었습니다. 추가적인 시각적 정보는 참고 자료 13을 참조하십시오. <ol><li> 모든 악기와 작업 영역을 70 %에탄올. </li><li> 인큐베이터 (6-10 사이)에서 원하는 달걀 세트 계란을 꺼내 실온에서 놔두고 70 % 에탄올로 달걀을 따로 따로 닦아냅니다. 계란은 인큐베이터 제거 후 적어도 2 시간 동안 실행 가능합니다. </li><li> 배아의 위치를 ​​확인하기 위해 빛 조명 장치 위에 계란을 놓습니다. 어두운 영역의 중심 ( 즉 , 배아)에 연필로 동그라미를 치십시오. </li><li> 19G 바늘을 사용하여 알의 둔한 끝 부분에 구멍을 뚫습니다. </li><li> 계란의 뾰족한면에 그려진 원 근처에 다른 구멍을 뚫습니다. 19G 바늘로 외부 알 껍질 (약 16mm 2 )의 작은 조각을 제거한 다음 포 셉를 사용하여 내부 달걀 껍질 (약 8mm 2 )의 작은 조각을 제거합니다. </li><li> 19G 바늘이 장착 된 3mL 주사기를 사용하여 무딘 말단 구멍을 통해 알에서 1.5-2.5mL의 알부민을 빼냅니다. 바늘을 45 °로 기울여야합니다. </li><li> 커팅 된 구멍을 작은 테이프 조각 (1cm x 1cm)으로 덮으십시오. 그려진 원을d 테이프로 두 번째 구멍 (2.5 cm x 4 cm). </li><li> 굽은 가위 (절삭 날 = 2.5cm)를 사용하여 원 안에 창을 자릅니다. 가위는 달걀 껍질과 평행해야하며 창문의 지름은 2cm 미만이어야합니다. </li></ol> 4. 플라스마 주입 <ol><li> 피코 스피처를 켜십시오. 압력을 18 psi로 설정하고 지속 시간을 5 μs로 설정하십시오. 해부 현미경에 대한 공기 탱크와 램프를 켭니다. </li><li> 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합 된 매장에서 구입 한 인도 잉크 1 : 10 희석액 30 mL 원액을 만드십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 인도 잉크의 주입은 닭 배아의보다 나은 시각화를 얻는 중요한 단계입니다. <ol><li> 희석 된 인도 잉크 용액으로 1 mL 주사기를 채 웁니다. 27G 바늘을 부착하고 주사기에있는 모든 거품을 뽑아 내십시오. </li><li> 배아에서 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 배아 아래에 약 0.2mL의 인도 잉크를 주입합니다. 해야 할 것배아 생존을 감소시킬 수 있으므로 인도어 잉크 0.5 mL 이상을 주입하지 마십시오. </li></ol></li><li> 해부 현미경 아래 계란 홀더에 창 계란을 놓습니다. 플라스미드 주사 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 가장 높은 배율을 사용하십시오. </li><li> 집게를 사용하여 주입 영역 위로 막을 제거하십시오. 관심의 청각 brainstem 지역 ( 즉 , NM과 NL) Rhombomeres 5와 6 (R5 / R6)에서 발생합니다. R5 / R6은 R5 / R6 플라스미드 주사의 지표가되는 otocysts (척수 동물의 내이에 발생하는 배아 구조)에 인접 해 있습니다. </li><li> R5 / R6 지역과 otocysts 사이에있는 신경 튜브에 micromanipulator를 사용하여 DNA 채워진 피펫을 낮추십시오. 이상적인 배치의 개략도가 그림 1A 에 나와 있습니다. </li><li> picospritzer에서 공기 압력 (18 psi, 5 μs duration)을 적용하여 신경 튜브의 DNA를 추출합니다. </li></ol> 5. 일렉트로 포 레이션 <ol><li> t를 켜십시오.그는 전류 / 전압 자극기입니다. </li><li> PBS와 3 ML 주사기를 채우고 주사기 필터를 첨부하십시오. 배아에 PBS 1-2 방울을 추가합니다. </li><li> 주사 사이트 (내측) 위의 음전극과 R5 / R6 ( 그림 1A )의 양극 측면과 micromanipulator를 사용하여 배아에 양극 전극을 낮추십시오. 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 전극 재료가 백금 이리듐 인 경우 양극 전극을 사용하십시오. 팁 사이의 간격을 집게로 0.5mm로 조정하십시오. </li><li> 전류 / 전압 자극기를 사용하여 50V에서 1 초 간격으로 20 회 펄스를 1 초 간격으로 펄스합니다. </li><li> electroporation 후 노출 영역 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 전극을 제거하고 실험실 조직과 70 % 에탄올로 청소하십시오. 배아를 테이프로 노출시키는 창을 닫습니다. </li><li> 주입 된 플라스미드 유형 및 해치 날짜로 달걀 껍질에 라벨을 붙입니다. </li><li> 창 측면과 함께 인큐베이터에 계란을 다시 넣으십시오. 38 ° C에서 50 °원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 습도 %. </li><li> 유전자 발현의 일시적인 조절을 위해 tet-on vector를 일렉트로 포 레이션하면 24 시간마다 Doxycycline (Dox)을 적용하여 유전자 발현을 유도한다 (6 절 참조). </li></ol> 6. 유전자 발현의 시간 제어를위한 Tet-on 시스템 <ol><li> 다음과 같은 플라스미드를 사용하십시오 : pCAGGS-T2TP : 플라스미드를 발현하는 트랜스포 아제. pT2K-CAGGS-rtTA-M2 : Dox 결합 단백질을 안정적으로 발현하는 플라스미드. pT2K-BI-TRE-EGFP : EGFP 리포터와 관심 두 번째 유전자의 양방향 tet-on promoter (TRE) 구동 구동을 포함하는 플라스미드. 참고 : 위의 세 가지 플라스미드는 1 : 1 : 1의 비율로 공동 electroporated해야합니다. </li><li> 재고 솔루션 준비 : <ol><li> Dox를 멸균 PBS에 녹여 1 mg / mL 저장 용액을 만듭니다. -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dox 응용 프로그램 : <ol><li> 표현을 유도하려면특정 발달 단계에서 관심 유전자의 n은 24 시간마다 Dox를 적용한다. </li><li> Dox를 적용 할 때, 계란을 꺼내 창을 열고, chorioallointoic 막에 50 μL Dox를 피펫, 창문을 닫고 인큐베이터에 다시 계란을 넣어. </li></ol></li></ol> 7. 뇌간 절편을위한 해부 영역의 준비 참고 : 다음 섹션 (7-9) 및 절차는 14 전에 게시되었습니다. 추가 시각적 정보는이 참조 자료를 참조하십시오. <ol><li> 한천 솔루션 (40mg / ML 아가로 오스, 즉 ddH 2 O 4 %)을 준비합니다. 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고되게하십시오. 조직을 뇌간 절단하는 동안 미래의 사용을 위해 냉장고에 한천 플레이트를 덮습니다. </li><li> 95 % O 2 및 5 % CO 2 (pH 7.2-7.4 및 삼투압 : 295-310 mOsm / L) 인 인공 대뇌 척수액 (ACSF)을 지속적으로 버블 링합니다.</li><li> 작업 영역과 vibratome을 70 % EtOH로 세척하고 칼날을 증류수로 헹구십시오. </li><li> 적절한 절개 공구로 작업 영역에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> 한천 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 작은 한천 큐브 (10mm x 10mm x 8mm)를 자릅니다. 시판되는 슈퍼 접착제를 사용하여 vibratome-slicing chamber의 한천 블록을 접착하십시오. </li></ol> 8. 치킨 청각 Brainstem의 격리 <ol><li> 녹화 된 창 사이트에서 알을 엽니 다. 메스로 멤브레인 낭을 찔러서 닭 배아의 머리를 제거하십시오. </li><li> 날카로운 가위로 닭고기를 처치하십시오. </li><li> 면도날 끝을 눈의 약간 뒤로 배치하십시오. 사타구니에서 꼬리 중간 선에서 두개골을 통해 절개하십시오. 배아의 나이에 따라 약간의 압력을가하십시오. 오래된 배아는 더 많은 압력을 필요로합니다. </li><li> 부드럽게 피부와 깃털을 옆으로 밀어서 두개골을 노출시키고 정중선 절단을 확인하십시오. </li><li> 적용뾰족한 압력, 면도날로 두개골의 주둥이 부분을 자릅니다. 즉시 눈 뒤쪽에 블레이드를 놓고 전체 두개골과 뇌 조직을 잘라냅니다. </li><li> 두개골의 꼬리 부분에있는 가위로 정중선 - 절개를 만들고 머리 양쪽에있는 목 근육의 약간 앞쪽에 위치시킨다. 두개골과 과잉 조직을 당겨 뇌와 소뇌를 노출시킨다. </li><li> 가위로 brainstem에 첨부 된 조직을 잘라 버리고 두개골에서 자유롭게 분리 brainstem를 제거하십시오. </li></ol> 생체 내 전기 생리학 또는 영상화를위한 뇌간 절편 준비 <ol><li> 광학 현미경을 통해 뇌간을 고정하십시오. </li><li> 가위로 peduncles를 절단하여 소뇌를 제거하고 넷째 뇌실 바닥을 드러내십시오. </li><li> 핀셋을 사용하여 막 조직 표면에서 멤브레인 모양의 조직과 혈관을 제거합니다. </li><li> 뇌간을 막으려면 4 층 바닥의 가장 주둥이 끝 부분을 수평으로 자릅니다.대뇌 피질에 바로 꼬리 인 심실. brainstem을 격리하기 위해 시신경을 통해 수직으로 측면 절단을하십시오. </li><li> 한천 블록 앞에 직접 vibratome 무대에 슈퍼 접착제의 소량을 놓으십시오. </li><li> 족집게를 사용하여 척수에서 뇌간을 들어 올리고 비듬면이 아래쪽이고 진동 면도날쪽으로 등 쪽의 슈퍼 접착제 위에 놓습니다. 실험실 조직이나 여과지로 과량의 접착제를 제거하십시오. </li><li> 산소가 공급 된 ACSF를 vibratome 단계에 붓는다. vibratome 블레이드를 20-22 ° 각도로 설정하십시오. 진동 진폭을 최대 진폭으로 시작하십시오. 조직의 상단이 날과 평행하도록 날을 향해 스테이지를 위로 이동하십시오. </li><li> 신속하게 뇌간 조직쪽으로 움직입니다. 블레이드가 조직과 접촉하기 전에 블레이드를 상당히 천천히 감속하십시오. </li><li> 가능한 한 가장 느린 전진 속도로 조직을 슬라이스하십시오. 블레이드가 전체 관상 조직 섹션을 통과하면, 전송 피펫을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 제거하십시오./ li&gt; <li> 200-300 μm의 단계를 낮추고 다시 슬라이스. 청각 핵의 해부학 적 랜드 마크가 눈에 보일 때까지 반복하십시오 (예 : NL의 뚜렷한 지느러미 / 복부 뉴로 필 영역 및 NL과 관련된 NM의 중간 위치). </li><li> ACFS에서 슬라이스를 조심스럽게 유지 관리하십시오. 이는 온수 욕조를 사용하여 실온 (22 ° C) 또는 생리 조건 (~ 41 ° C)에서 수행 할 수 있습니다. 슬라이스 순서에 유의하십시오. 첫 번째 슬라이스는 조직의 가장 꼬리 부분에 해당하고 마지막 슬라이스는 가장 주둥이 영역에 해당합니다. 이것은 대략 저주파수에서 고주파 인코딩 영역까지의 청각 뇌간 구조의 톤토 피스크 구성을 대략적으로 나타냅니다. </li></ol>

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비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 ...

소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발. 개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.

우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporati...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K 조회수.  Northwestern University.  조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다. 

비디오: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

연구

신경과학

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

발생학

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

생물학

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

긴장성 구배와 미세 회로를 평가하기 위해 배아 닭 청각 뇌간 절단

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

치킨 부화의 청각 뇌간 반응 평가

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

요약

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