The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Todos os experimentos, incluindo seres humanos foram aprovados pelo comitê de ética local (aprovação no. 3/2/14). Para a escolha dos pacientes deve-se notar que diversos fatores, tais como idade, sexo, regimes terapêuticos atuais e muitos mais podem influenciar a composição MV no sangue e, portanto, devem ser levados em consideração antes da coleta da amostra 22,23. 1. Preparação de amostras de plasma <ol><li> Desenhe 1 - 2 tubos de sangue por doador, através de uma agulha de borboleta de calibre 21 em um tubo vacutainer colheita de sangue contendo EDTA (1,6 mg / mL de sangue). Certifique-se de inverter o tubo (s) várias vezes para garantir anticoagulação sangue eficiente. NOTA: O volume recomendado de sangue por citometria de fluxo e posterior análise de Western Blot é de 5 - 15 mL. A fim de evitar a degradação e perda de MV, as amostras de sangue deverão ser manuseados &lt;30 min após a retirada do sangue. </li><li> Preparar as amostras de plasma por centrifugação das amostras durante 15 minutos a 1200 xg àtemperatura ambiente (RT). </li><li> Aplicar um filtro de válvula, a fim de ajudar a separação de plasma (= camada superior) do restante células do sangue (= camada inferior). </li><li> Transfira o plasma para um tubo de 15 mL. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 1500 xg, temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares e maiores remover plaquetas remanescentes. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de 15 ml e proceder diretamente com amostras de isolamento ou de loja MV para até 6 meses a -20 ° C. NOTA: O protocolo apresentado também pode ser usado para isolar e (MVs Exos) a partir de sobrenadantes de cultura de células. A fim de fazer isso, cultivar as células a 60 - 80% de confluência, durante 24 - 48 h em meio de cultura suplementado com FCS a depleção de vesícula, e em seguida, recolher o sobrenadante. Centrifugar durante 5 minutos a 750 xg, a 4 ° C para destruir as células flutuantes residuais, encher o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e centrifugar de novo durante 5 min a 1500 xg, 4 ° C para sedimentar os detritos celulares maior. Este sobrenadante pode então ser usado para o isolamento de MVstal como descrito no Passo 2,1-2,16. </li></ol> 2. Isolamento de MVs <ol><li> Transfira a amostra de plasma num tubo de centrifugação adequado. Se necessário, encher tubo com PBS, a fim de diluir a amostra e evitar o colapso de tubos de paredes finas durante o processo de centrifugação. </li><li> Centrifugar durante 35 minutos a 14000 xg, 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante, mantenha tubos virou de cabeça para baixo e coloque sobre uma toalha de papel. Espera 3-5 minutos até que todo o restante sobrenadante foi embebido na toalha e assim removido a partir da amostra. </li><li> Ressuspender o sedimento em MV 1000 ul de PBS, transferido para um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se durante 35 min a 14000 xg, a 4 ° C numa centrífuga de mesa. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento MV em 50-500 ul de PBS, dependendo do tamanho do pelete. Alternativamente, lisam MVs directamente, por exemplo, em tampão de RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-desoxicolato / 1% de Triton X-100 / Tris 50 mM, pH 7,2)para análise de Western Blot subsequente. MVs armazenar a -20 ° C. Eles vão permanecer estável durante vários meses, mas evitar congelamento e descongelamento ciclos repetidos. </li><li> Opcional: Determinar a concentração de proteína MV com um ensaio de proteína (por exemplo, Bradford ou método de Lowry), a fim de avaliar o rendimento mV ou dosear MVS para experiências subsequentes. </li><li> Se Exos adicionais são para ser isolado a partir das amostras de plasma, decanta-se o sobrenadante a partir do passo 2.3 para um tubo de ultracentrifugação e centrifuga-se durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C. Decantar o sobrenadante tal como descrito no passo 2.3, ressuspender Exo sedimento em 1000 uL de PBS e transferir para pequenas (1,5 ml) tubos de ultracentrifugação. <ol><li> Ultracentrífuga durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C, o sobrenadante aspirado e ressuspender o pellet em Exo 50-75 ul de PBS ou tampão RIPA. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização de MVs por citometria de fluxo <ol><li> Transferir 15 uL de PBS + 1% de soro fetal de vitelo empobrecido de vesículas (FCS) num tubo de citometria de fluxo. NOTA: vesículas com FCS empobrecido é preparado por centrifugação inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de FCS durante 18 h a 110000 xg e filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 um, tal como descrito anteriormente 24. </li><li> Adicionam-se 5 ug (em caso de baixos rendimentos 3 ig), são igualmente aplicáveis ​​de MVs em PBS. </li><li> Incubar as amostras durante 30 min à temperatura ambiente, a fim de bloquear os sítios de ligação não específicos na superfície de MV e, assim, reduzir a coloração de fundo. </li><li> Adicionar um anticorpo marcado por fluorescência contra o interesse da proteína-de-. Titula-se a quantidade de anticorpo utilizada para a mancha, antes da utilização, a fim de determinar a concentração óptima e garantir uma ração baixo sinal-para-ruído. Certifique-se também incluir um tubo com MVs não coradas como controlo negativo e um tubo de MVs coradas com o anticorpo de controlo de isotipo correspondente à mesma concentração (por exemplo, se 1 ug de anticorpo é utilizado, também utilizar um ug do um controlo de isotipotibody) para quantificar a coloração de fundo. NOTA: Também é possível realizar fluxo multicolor citometria adicionando vários anticorpos acoplados a diferentes fluorocromos. </li><li> Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 250 mL PBS e proceder com a medição da amostra usando um citômetro de fluxo. <ol><li> No caso de amostras que não pode ser medida de imediato, adicionar 150 ul de PBS e 50 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as amostras e armazenar a 4 ° C. CUIDADO: PFA é tóxico. Use luvas e equipamento de protecção individual adequado. </li></ol></li><li> Reduzir o limiar do citômetro de fluxo para o valor mais baixo possível e procurar a população MV usando uma dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) enredo em escala logarítmica. Porta na população MV e avaliar o sinal de fluorescência em um histograma correspondente. </li></ol> 4. Caracterização de MVs por Western Blotting <ol><li> Ressuspender o sedimento em MV directamenteum tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). <ol><li> No caso de o sedimento MV já foi ressuspenso em PBS, diluir, pelo menos, 1: 1 num tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). </li></ol></li><li> Determinar a concentração de proteína da amostra MV, por exemplo, por ensaio de Lowry. </li><li> Preparar 10-20 ug de MVs em 22,5 ul de tampão RIPA. Em seguida, adicionar 7,5 mL de 4x tampão de carga Laemmli e calor durante 5 minutos a 95 ° C. </li><li> Carregar as amostras sobre um gel de poliacrilamida e realizar electroforese e imunotransf erência de acordo com protocolos padrão. </li><li> Depois de transferir as proteínas para a membrana, realizar uma coloração de Ponceau como um controlo de carregamento de acordo com protocolos padrão. </li><li> membrana Destain em TBST durante 5 min à TA. </li><li> Bloco de membrana durante 30 min até 1 h, à RT, em 5% de BSA em TBST. </li><li> Incubar membrana com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite ou durante 2 h à TA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3 x 5 min.</li><li> Incubar membrana com o anticorpo secundário acoplado a HRP a uma diluição de 1: 10000 em BSA a 5%. Nota: Em caso de sinais de alta fundo, use leite em pó em vez de BSA. </li><li> Lava-se a membrana com TBST 3x 5 minutos. </li><li> Desenvolver membrana com um reagente de detecção ECL e detecção de sinais de quimioluminescência em filmes ou um sistema de imagem de quimioluminescência. NOTA: No fim de discriminar MVs de Exos, proteínas como Tubulin, actinina-4 ou mitofilin pode ser usado que deve ser, sobretudo, presente no MVs 16,25. Prestar atenção que os anticorpos mais tetraspaninas (por exemplo, CD9, CD81), utilizados como marcadores para Exos, não funcionam sob condições redutoras e deve, portanto, ser preparados em tampão não redutor de carga seguido por aquecimento durante 10 min a 70 ° C. </li></ol>

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	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Estudos recentes sobre EVs no sangue demonstraram que a composição e as contagens EV mudar durante a causa de várias doenças. Portanto, a análise e posterior caracterização destas EVs são de grande interesse para avaliar melhor a sua utilização potencial como biomarcadores da doença para diagnóstico e prognóstico ou para avaliar as respostas de terapia. O protocolo apresentamos aqui permite o isolamento de vesículas com um diâmetro de até 600 nm, que não contêm quaisquer organelos celulares. Estas observações estão em consonância com a actual definição de MVs e excluir a presença de corpos apoptóticos 2. Usando a técnica Western Blot, fomos capazes de demonstrar que as MVs isolados mostram uma elevada expressão da tubulina, enquanto que os tetraspanins CD9 e CD81 que são frequentemente usados ​​como marcadores Exo foram apenas ligeiramente expressa. Isto confirma que MVs diferem de Exos e se encaixa a recente caracterização em profundidade e comparação de ambas as populações EV por proteômica 25. conteúdo &quot;&gt; Durante a aquisição de amostras de sangue, é crítico para manter o tempo entre a punção venosa e preparação plasma tão curto quanto possível, a fim de evitar a degradação do MV. Além disso, o armazenamento prolongado de amostras de sangue pode levar à activação de células de sangue causando reforçada MV derramamento e, finalmente, a apoptose, que resulta na libertação de corpos apoptóticos. Outra consideração importante para o isolamento MV é para evitar contaminações de preparações MV com proteínas do plasma ou Exos menores. Portanto, é essencial para remover tanto do sobrenadante quanto possível depois de girar para baixo MVS a 14000 x g. uma vez que o sedimento é normalmente visível e firmemente fixado à parede do tubo, o sobrenadante pode ser facilmente removido com uma ponta de pipeta. Em contraste com Exos que tendem a formar agregados durante a preparação por ultracentrifugação alta velocidade e são muitas vezes difíceis para voltar a suspender, este problema não ocorre com MVs. Nosso estudo mostra que é possible para caracterizar subpopulações MV presentes no sangue por citometria de fluxo. Embora o limite de detecção da maioria dos citómetros de fluxo é de cerca de 200-300 nm, o MVS foram reprodutivelmente medido no dador, bem como amostras de cultura de células com os mesmos parâmetros de análise e portões que permitiram claramente a sua distinção de sinais de fundo. É importante verificar antes das medições que o PBS usado para as análises não contém quaisquer partículas contaminantes que poderiam causar um fundo elevado durante a citometria de fluxo (Figura 3). Embora alguns MVs menores não pode ser capturado numa abordagem por citometria de fluxo, verificou-MVs de todas as principais populações de células do sangue (por exemplo, plaquetas, glóbulos vermelhos, leucócitos, células endoteliais). Em nossas análises usamos marcadores padrão para as diferentes células do sangue que tenham sido previamente encontrados no MVS 26 - 29. Deve notar-se que, a fim de obter os melhores resultados possíveis por citometria de fluxo, tele quantidade e a concentração de todos os anticorpos devem ser tituladas numa amostra MV expressando o antigénio de interesse. Se subpopulações MV específicos no sangue devem ser identificados com maior especificidade, é possível realizar a coloração dupla contra dois antigénios diferentes presentes nos respectivos MVs e considerar apenas todas as MVs duplamente positivas para posterior análise 23. Atualmente, existem esforços para definir uma escala padrão de subpopulações de MT no sangue de indivíduos saudáveis 23,30. Estes estudos já demonstraram que MVs derivados de plaquetas constituem a maior população de MVs no sangue que está em correspondência com as nossas observações. Uma vantagem da citometria de fluxo para caracterizar amostras de MT é que este método já está bem estabelecida para fins de diagnóstico, na maioria dos centros clínicos que permitam o possível uso de MVs como biomarcadores no diagnóstico clínico diárias. Estudos anteriores sobre EVs no sangue que têm na sua maioria focoed em Exos menores, dependem tanto procedimentos de classificação específicos para analisar selectivamente a população alvo desejado Exo 31,32 ou requerem um (2 dias) Processo de isolamento demorado com acoplamento de Exos a pérolas de látex antes da análise 18. As nossas próprias observações não publicadas sugerem que a análise de citometria de fluxo de MVs de preparações de sangue inteiro mesmo permite a detecção de MVs como MVs derivadas de tumor sem qualquer desses processos de selecção. Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite o isolamento rápido de MVs a partir de amostras de sangue periférico com equipamentos de laboratório padrão e sua qualificação ulterior por citometria de fluxo e Western Blotting. Todo o processo pode ser realizado em cerca de 2 h, o que vai facilitar futuros estudos sobre perfis de MT em sangue de pacientes que são necessárias para avaliar o potencial de MVs como biomarcadores da doença.

Nos últimos anos, muitos estudos in vitro têm demonstrado que vesículas extracelulares (VE) desempenham um papel importante na comunicação intercelular. As células vivas constantemente eliminado vesículas que diferem em tamanho, conteúdo e biogênese. Os EVs melhor estudados são exosomes que se originam a partir do sistema endossomal onde eles são armazenados como vesículas intraluminais em corpos multivesiculares. Uma vez que esta última se fundem com a membrana plasmática, as vesículas contidos são libertados como exossomas (Exos, diâmetro de 30-100 nm 1). A segunda população de EV que ganha cada vez mais atenção nos últimos anos, são grandes microvesículas (MVs, diâmetro de 100 - 1.000 nm), que brotam diretamente da membrana plasmática 2. Ambos os tipos de vesículas estão rodeados por uma bicamada lipídica e contêm ácidos nucleicos, por exemplo, ADN, ARNm ou miARN 3-5, e uma variedade de proteínas que se podem transferir para C vizinhaells. Embora, em geral, a composição de proteína das vesículas reflecte o estado de uma célula de origem, algumas proteínas parecem ser selectivamente orientadas e enriquecido em VE 1. Uma grande interesse de pesquisa é caracterizar EVs de células anormais e doentes, a fim de definir assinaturas EV específicas que possam permitir o uso de EVs como novos biomarcadores. Especialmente no cancro, em que muitas vezes o próprio tumor não é facilmente acessível, biópsias líquidos segmentação VE específicos de tumores no sangue pode permitir a monitoração das respostas terapia ou ajudar a caracterização do tumor primário, sem a necessidade de procedimentos invasivos 6. Na verdade, EVs já foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais, incluindo urina 7, 8 CSF, o leite materno 9 ou sangue 10. Vários estudos identificaram alterações nas contagens de EV e composição em diferentes doenças humanas. Por exemplo, em pacientes com sepsia o número de MVs pró-coagulante éaumentou significativamente em comparação com indivíduos saudáveis 11. Também em pacientes com malária cerebral grave um aumento no total de MVs no sangue pode ser observada e contagens de MVs derivados de plaquetas correlacionar com profundidade coma e trombocitopenia 12. Outros estudos relatam números elevados de vesículas derivados do endotélio em doentes com lúpus eritematoso sistémico ou insuficiência cardíaca e, no caso deste último, esta está correlacionada com uma maior probabilidade de eventos cardiovasculares 13,14. Especialmente no câncer, EVs no sangue estão atualmente discutido como novos biomarcadores com valor diagnóstico e prognóstico. Níveis de MVs que expressam proteínas associadas a tumores, tais como MUC-1, EGFR ou FAK parecem ser elevados no sangue de doentes com cancro da mama 15,16. Também para Exos, estudos recentes têm mostrado que Exos derivados do sangue que transportam antígenos específicos do tumor, como glipicano-1 para câncer de pâncreas ou Del-1 para o cancro da mama permitir cedo a doença deproteção com alta especificidade e sensibilidade 17,18. Adicionalmente, o tumor derivada de soro Exos pode conter ADN que pode ser utilizado para a detecção de mutações, tais como KRAS e p53 que sugere a sua utilização para a terapia de previsão 19. Avanços recentes têm mostrado que a análise de Exos no sangue de pacientes com glioblastoma utilizando um chip de microfluidos específica permite a monitorização da terapia 20. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a análise de subpopulações de doenças específicas de vesículas dá informações preciosas sobre diagnóstico, prognóstico, bem como as opções terapêuticas e sucesso. No entanto, o isolamento e análise de Exos de sangue é morosa, requer equipamento especial de laboratório e, por conseguinte, ainda não é adequado para o diagnóstico clínico de rotina. Em contraste, o MVS pode ser isolado muito mais rapidamente e, devido ao seu grande tamanho, podem ser facilmente analisadas por citometria de fluxo, sem a necessidade de associá-los a esferas de látex, uma vez que é necessário para Exos 18, 21. Assim, aqui se apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o isolamento de MVs padronizado a partir de amostras de sangue e a subsequente caracterização de sub-populações de MT por citometria de fluxo. Este protocolo irá permitir o estudo adicional e caracterização em profundidade de perfis de MT em grandes grupos de pacientes que serão necessários, a fim de utilizar MVS para diagnósticos clínicos diárias.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

A liberação de vesículas extracelulares (SVE), incluindo as pequenas exossomos-endossomal (Exos, diâmetro &lt;100 nm) e microvesículas derivados de membrana grande de plasma (MVs, diâmetro&gt; 100 nm) é um processo celular fundamental que ocorre em todas as células vivas. Estas proteínas de transporte de vesículas, lípidos e ácidos nucleicos específicas para a sua célula de origem e em estudos in vitro em destaque a sua importância como mediadores de comunicação intercelular. VE foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais e, especialmente, os VE no sangue foram identificados como promissores biomarcadores para cancro ou doenças infecciosas. A fim de permitir o estudo de subpopulações MV no sangue, apresentamos um protocolo normalizado para o isolamento e caracterização de MVs a partir de amostras de sangue periférico. MVS são sedimentadas a partir de amostras de plasma anticoagulado com EDTA por centrifugação diferencial e, tipicamente, possuem um diâmetro de 100-600 nm. Devido ao seu tamanho maior, eles podemfacilmente ser estudada por citometria de fluxo, uma técnica que é utilizada rotineiramente em diagnósticos clínicos e está disponível na maior parte dos laboratórios. Vários exemplos de ensaios para as MVs isolado de controlo de qualidade vai ser dada e marcadores que podem ser utilizados para a discriminação de diferentes subpopulações de MT no sangue vai ser apresentado.

A fim de quantificar o rendimento de MVs que podem ser isolados seguindo o protocolo descrito, calculou-se a quantidade de MVs isoladas a partir de amostras de sangue de 10 dadores. O rendimento MV, que foi avaliada num ensaio de proteínas de Lowry, variou de 10 até 30 ^ g, com uma média de 19,2 ug MVs por mL de sangue (Tabela 1). A concentração de partículas determinado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) variou de 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 com uma média de 5,9 x 10 9 partículas por ml amostra de plasma (Tabela 2). Além disso caracterização das MVs por microscopia eletrônica de transmissão revelou uma população de vesículas com um diâmetro&gt; 100 nm que foram cercados por uma bicamada lipídica e não contêm quaisquer organelos celulares (Figura 1A). NTA confirmou que o tamanho das MVs isolados variou de 100 a 600 nm (Figura 1B) e o tamanho médio foi de 201 MVnm (Figura 1C). A coloração para marcadores típicos de MT e Exo por Western Blotting demonstrado que as MVs isoladas foram positivas para a tubulina e mostrou apenas uma ligeira expressão de CD81 e CD9, enquanto Exos foram negativos para a tubulina e enriquecido em CD9 e CD81 (Figura 2). Análise dos MVs isoladas por citometria de fluxo (Figura 3A) revelaram uma população de vesículas definidas que poderia ser fechado usando os mesmos parâmetros normalmente utilizados para MVS isolados a partir de sobrenadantes de cultura de células e que foi claramente diferente da do sinal de fundo obtido pela medida de PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem a adição de MVs (Figura 3B). De modo a analisar as diferentes populações MV presentes no sangue, o MVS foram coradas com marcadores estabelecidos para as diferentes populações de células do sangue, por exemplo, CD62P para MVS derivados de plaquetas, CD45 para MVS derivados de leucócitos, para CD235aMVs e CD62E sangue vermelho de células-derivadas para MVS derivadas de células endoteliais (Figura 4). Esta caracterização mostrou que a percentagem de subpopulações MV diferiu entre as amostras de sangue do dador investigados, enquanto a maioria de MVs parecia ser derramado por plaquetas em todas as amostras. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Figura 1: Distribuição do Tamanho de MVs isoladas do sangue periférico. A, isolados MVs foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão. B, análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) de MVs que ilustram a distribuição de tamanhos das vesículas. C, O tamanho médio MV a partir de 10 preparações independentes foi medida por NTA (média). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver al</a>versão Arger desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Figura 2: Caracterização de MVs isolado por Western Blotting. a expressão da proteína diferencial nas MVs isoladas e Exos de dois doadores foi visualizado por Western Blot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Figura 3: Análise de MVs por citometria de fluxo. A, MVs são primeiro visualizadas em frente (FSC) versus espalhamento lateral parcelas (SSC) para a porta na respectiva população MV. Subsequentemente, estes são caracterizados MVs para o antigénio de interesse pela<html> utilizando anticorpos marcados com fluorescência dirigidos contra o antigénio. B, o FSC SSC típica contra parcelas para MVS isoladas a partir do plasma de dois dadores. Como comparação, um lote típico para MVS derivadas de células de tumor a partir de células de cancro do pulmão A549, isolado a partir do sobrenadante de cultura de células, bem como um controlo negativo utilizando apenas PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem MVS são mostradas à direita. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Figura 4: Caracterização de MVs isolado por citometria de fluxo. MVs de três dadores foram caracterizadas para a expressão de marcadores de células de sangue vermelhas estabelecidos (), por citometria de fluxo. Os respectivos controlos isotípicos são mostradas em cinza.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de sangue [g] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29,4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31,1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22,7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18,7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15,0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11,9 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: rendimento de proteína de MV amostras de sangue periférico. </strong&gt; É mostrada a quantidade de MVs por sangue periférico mL que foi elaborada a partir de 10 doadores. MV rendimentos foram quantificados por ensaio de Lowry. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> MVs / mL de plasma [contagem de partículas] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: MV Rendimento de partículas a partir de amostras de sangue periférico. </stRong&gt; MV foram isolados a partir de amostras de plasma de 10 doadores e contagens de partículas foram determinadas por análise de rastreamento de nanopartículas. É mostrado o valor médio de três medidas independentes.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K visualizações.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Bioquímica

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Pesquisa do câncer

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Bioengenharia

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Imunologia e Infecção

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicina

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Biologia

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Estudos de biomarcadores cardiovasculares usando proteoma de vesícula extracelular plasmática

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando na análise do proteoma da vesícula extracelular plasmática para estudos de biomarcadores cardiovasculares

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...