The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

ヒト被験者を含む全ての実験は、地元の倫理委員会（承認なし。3/2/14）によって承認されています。患者の選択のためには、年齢、性別、現在の治療レジメンと、より多くのようないくつかの要因が、血液中のMVの組成に影響を与えることができ、したがって、前のサンプル収集22,23に考慮されるべきであることに留意すべきです。 血漿サンプルの調製<ol><li> EDTA（1.6ミリグラム/ mLの血液）を含有するバキュテナー採血管に21ゲージのバタフライ針を通してドナーあたりの血液の2チューブ - 1を描画します。効率的な血液抗凝固を保証するために、チューブ（複数可）を数回反転させていることを確認してください。 注： - 15 mLのその後のフローサイトメトリーおよびウエスタンブロット分析のための血液の推奨量は5です。 MVの分解及び損失を防止するために、血液試料を30分採血後&lt;取り扱われるべきです。 </li><li>で1200×gで15分間サンプルを遠心分離して血漿試料を調製室温（RT）。 </li><li>残りの血液細胞（=下層）からの血漿（=上層）の分離を助けるために、バルブフィルタを適用します。 </li><li> 15 mLのチューブにプラズマを転送します。 </li><li> 1500×gで15分間遠心し、RTは、より大きな細胞破片をペレット化し、残りの血小板を除去しました。 </li><li> 15 mLのチューブに上清を移し、直接-20℃で6ヶ月までのためのMV分離またはストアサンプルを進めます。 注：提示プロトコルは、細胞培養上清からのMV（およびEXOS）を単離するために使用することができます。 24のための80％の密集度 - - そうするためには、60で細胞を培養小胞枯渇FCSを添加した培地で48時間、その後、上清を収集します。 750×gで5分間、4°Cの遠心分離機は、残留浮遊細胞を枯渇させる大きな細胞残屑をペレットに1,500×gで、4℃で5分間、再度新しい15 mLチューブと遠心分離機に上清を充填します。この上清を、次いでMVの単離のために使用することができます2.16 - ステップ2.1で説明したように。 </li></ol> MVの2の単離<ol><li>適切な遠心チューブに血漿サンプルを転送します。必要であれば、試料を希釈し、遠心分離手順の間に薄肉管の崩壊を防ぐためにPBSでチューブを埋めます。 </li><li> 14,000×gで、4℃で35分間の遠心分離。 </li><li>上清をデカント、管が逆さまになって、ペーパータオル上に置いておきます。すべての残りの上清は、タオルに浸漬し、それによって試料から除去されるまで5分 - 3を待ちます。 </li><li>千μLPBSでMVペレットを再懸濁し、卓上遠心機で14,000×gで、4℃で35分間、1.5 mLのチューブと遠心分離機に移します。 </li><li>上清を吸引。 </li><li>ペレットの大きさに応じて、500μLのPBS - 50にMVペレットを再懸濁します。あるいは、溶解のMV直接、 例えば 、RIPA緩衝液（150mMのNaCl / 0.1％SDS / 0.5％デオキシコール酸Na / 1％トリトンX-100 / 50mMのトリス、pH7.2）でその後のウェスタンブロット分析のために。 -20℃で保存するのMV。彼らは、数ヶ月間安定したままですが、繰り返し凍結融解サイクルを回避することができます。 </li><li>オプション：次の実験のためのMVの収量や用量のMVを評価するために、タンパク質アッセイ（ 例えば 、ブラッドフォードやローリー法）とMVのタンパク質濃度を決定します。 </li><li>追加EXOSは、血漿サンプルから単離する場合は、11万XG、4°Cで2時間超遠心チューブと遠心分離機にステップ2.3から上清をデカント。ステップ2.3で説明したように上清を除去、千μLのPBSにエキソペレットを再懸濁し、小（1.5 mL）を超遠心チューブに移します。 <ol><li> 75μLPBSまたはRIPA緩衝液 - 11万×gで、4°C、上清を吸引し、50でエキソペレットを再懸濁で2時間超遠心機。 </li></ol></li></ol>フローサイトメトリーによるMVの3キャラクタリゼーション<ol><li>転送15μLのPBS + 1％の小胞枯渇ウシ胎児血清（FフローサイトメトリーチューブでCS）。 注：ベシクル枯渇FCSを11万×gで18時間熱不活化（56℃、30分）FCS遠心分離し、先に説明したように24、0.2μmのフィルターを通して上清を濾過することによって調製されます。 </li><li> PBS中のMVの5μgの（3μgのも適用可能であり、低利回りの場合）を追加します。 </li><li> MV表面に非特異的結合部位をブロックし、それによりバックグラウンド染色を減少させるために室温で30分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>タンパク質の関心に対する蛍光標識抗体を追加します。最適濃度を決定し、低い信号対雑音比を保証するために使用する前に、染色のために使用される抗体の量を滴定します。また、陰性対照として未染色のMVと1チューブと（1μgの抗体が使用される場合、例えば 、また、アイソタイプコントロールAN1μgのを使用するのと同じ濃度で一致するアイソタイプ対照抗体で染色したMVの1チューブを含むようにしてくださいバックグラウンド染色を定量するtibody）。 注：これは、異なる蛍光色素に結合された複数の抗体を添加することにより、多色フローサイトメトリーを行うことも可能です。 </li><li>暗所でRTで20分間インキュベートします。 </li><li> 250μLのPBSを加え、フローサイトメーターを用いて、試料の測定を進めます。 <ol><li>ケースではサンプルがすぐに測定することができないことを、4°Cでのサンプルや店舗を修正するために150μLのPBSおよび50μLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加します。注意：PFAは有毒です。手袋、適切な個人用保護具を使用します。 </li></ol></li><li>可能な限り低い値にフローサイトメーターのしきい値を減らして、対数スケールで側方散乱（SSC）プロット対前方散乱（FSC）を使用して、MVの人口を検索します。 MV集団に対するゲートとは、対応するヒストグラムの蛍光シグナルを評価します。 </li></ol>ウェスタンブロッティングによるMVの4キャラクタリゼーション<ol><li>直接MVペレットを再懸濁適切な溶解バッファー（ 例えば 、RIPAバッファー）。 <ol><li>適切な溶解緩衝液（ 例えば 、RIPA緩衝液）中で1：MVペレットを既にPBS中に再懸濁された場合に、それを少なくとも1希釈します。 </li></ol></li><li>ローリーアッセイによって、例えば 、MVのサンプルのタンパク質濃度を決定します。 </li><li> 22.5μLRIPA緩衝液中のMVの20μgの - 10を準備します。次いで、95℃で5分間、7.5μL4倍のLaemmliローディング緩衝液と熱を加えます。 </li><li>ポリアクリルアミドゲル上の負荷サンプルとは、標準的なプロトコルに従って電気泳動およびイムノブロッティングを行います。 </li><li>メンブレンにタンパク質を転写した後、標準的なプロトコルに従ってローディングコントロールとしてポンソー染色を行います。 </li><li>室温で5分間TBST中で脱色膜。 </li><li> TBST中の5％BSA中、室温で1時間に30分までのブロック膜。 </li><li>一晩または室温で2時間4℃で一次抗体と共に膜をインキュベートします。 </li><li> TBST 3×5分で膜を洗浄します。</li><li> 5％BSA 10,000：1の希釈でHRP結合二次抗体で膜をインキュベートします。注：高いバックグラウンド信号の場合には、代わりにBSAの粉乳を使用します。 </li><li> TBST 3×5分で膜を洗浄します。 </li><li> ECL検出試薬を有する膜を開発し、化学発光フィルムまたは化学発光画像化システムの信号を検出します。 注：EXOSからのMVを識別するために、チューブリンのようなタンパク質は、使用することができる4アクチニン又はmitofilin主のMV 16,25上に存在する必要があります。 EXOSのためのマーカーとして使用される最もテトラスパニン抗体（ 例えば、CD9、CD81）は、還元条件下で動作しないため、70℃で10分間加熱することにより、非還元ローディング緩衝液中で調製されるべき注意を払ってください。 </li></ol>

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D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html>血液中の電気自動車に関する最近の研究は、EV組成とカウントは、いくつかの疾患の原因の間に変化することを明らかにしました。したがって、これらの電気自動車の分析およびさらなる特徴は、さらに、診断および予後のための疾患バイオマーカーとしてのそれらの潜在的使用を評価するために、または治療応答を評価するために、高い関心が持たれています。私たちがここで紹介するプロトコルは、任意の細胞小器官を含まない最大600ナノメートルの直径を有する小胞の単離を可能にします。これらの観察は、MVの現在の定義に沿ったものであり、アポトーシス体2の存在を除外します。ウェスタンブロッティングを使用して、私たちはしばしばエキソマーカーとして使用されているテトラスパニンCD9とCD81はわずかしか発現していた一方で、単離されたMVは、チューブリンの高い発現を示すことを実証することができました。これは、MVSがEXOSとは異なり、最近の綿密な特性評価およびプロテオミクス25の両方によってEV集団の比較に適合することを確認します。 血液サンプルの取得時に内容が &quot;&gt;は、MVの劣化を防止するために、静脈穿刺、できるだけ短い血漿調製物の間の時間を維持することが重要である。また、血液試料の長期保存を向上MVを引き起こす血液細胞の活性化につながる可能性が脱落し、最終的にアポトーシス体の放出をもたらす。MVの単離のためのもう一つの重要な考慮事項は、血漿タンパク質または小さいEXOSとMV製剤の汚染を防止するためであるアポトーシス。したがって、スピンダウンした後、可能な限り上清をできるだけ多く除去することが重要です高速超遠心分離によって調製中に凝集体を形成する傾向が14,000 X gでのMV。ペレットは、通常、可視及びしっかりチューブの壁に取り付けられているので、上清を容易にピペットチップを用いて除去することができる。EXOSとは対照的にと頻繁に再懸濁するのは難しいです、この問題は、MVSでは発生しません。 我々の研究は、それがpossiであることを示していますフローサイトメトリーによる血中に存在するMVの亜集団を特徴づけることがBLE。ほとんどのフローサイトメーターの検出限界は約200であるが - は300nm、のMVを再現明らかに背景信号からそれらの区別を可能にした同じ分析のパラメータおよびゲートを有するドナーならびに細胞培養サンプルで測定しました。 PBSは、フローサイトメトリー（ 図3）の間に高いバックグラウンドを引き起こす可能性のある汚染粒子が含まれていない分析に使用し、測定する前に確認することが重要です。いくつかの小さい方のMVは、フローサイトメトリー法で捕獲されていないかもしれないが、我々はすべての主要な血液細胞集団（ 例えば 、血小板、赤血球、白血球、内皮細胞）からのMVを検出しました。 29 -我々の分析では、以前のMV 26日に発見されている別の血液細胞のための標準的なマーカーを使用していました。なお、Tフローサイトメトリーによって、可能な限り最高の結果を得るためにすべての抗体の彼量と濃度は、目的の抗原を発現するMVサンプルに滴定する必要があります。血液中の特定のMV亜集団は、高い特異性で特定されなければならない場合、それぞれのMV上に存在する二つの異なる抗原に対する二重染色を行い、わずか23を分析し 、後続のすべての二重陽性のMVを考慮することが可能です。現在、健康な個体23,30の血液中のMV亜集団の標準範囲を定義するための努力があります。これらの研究は、すでに血小板由来のMVは、私たちの観察と対応している血液中のMVの最大の人口を構成していることが示されています。 MVサンプルを特徴付けるためにフローサイトメトリーの一つの利点は、この方法は、すでによく日常臨床診断におけるバイオマーカーとしてのMVの可能な使用を可能にする最も臨床センターにおける診断目的のために確立されることです。主にフォーカスを持っている血液中の電気自動車に関するこれまでの研究小さいEXOSに編、選択的に目的のエキソの標的集団31,32を分析したり、分析前18にビーズをラテックスにEXOSのカップリングと時間がかかる（2日）分離工程を必要とするように、特定の並べ替え手順のいずれかに依存しています。我々自身の未発表の観察は、全血液製剤からのMVのフローサイトメトリー分析はさらに、そのような選択プロセスなしに、腫瘍由来のMVのようなMVの検出を可能にすることを示唆しています。 ここで紹介するプロトコルは、標準的な実験室の機器との末梢血液サンプルからMVの高速分離を可能にし、それらのその後の特徴付けは、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロッティング使用して、一緒になって。全体のプロセスは、疾患のバイオマーカーとしてのMVの可能性を評価するために必要とされる患者の血液中のMVプロファイルに関する今後の研究を促進するであろう約2時間で行うことができます。

最後の年ではin vitro試験での多くは、細胞外小胞（電気自動車）の間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしていることを実証しました。生きている細胞は常にサイズ、コンテンツおよび生合成において異なる小胞を流しました。最も研究電気自動車は、それらが多胞体内腔内小胞として保存されているエンドソームシステムから発信エキソソームです。原形質膜と後者のヒューズたら、含まれる小胞は、エキソソームとしてリリースされている（EXOS、直径30から100 nmの1）。原形質膜2から直接出芽-最後の年でますます注目を集めているEVの第二の集団は、大きな微小胞（1000nmでのMV、直径100）です。 5、そして、彼らは隣のCに転送することができ、タンパク質の過多-小胞の両方のタイプは、 例えば、DNA、mRNA、またはmiRNAの3を脂質二重層に囲まれ、核酸を含有していますells。一般的に、小胞のタンパク質組成物は、起源の細胞の状態を反映しているが、いくつかのタンパク質は、選択的に標的と電気自動車1に濃縮されているように見えます。主要な研究関心は、新規バイオマーカーとしての電気自動車の使用を可能にするかもしれない特定のEVシグネチャを定義するために、異常と疾患細胞から電気自動車を特徴付けることです。特に、多くの場合、腫瘍自体は簡単にアクセスすることはできませんした癌で、血液中の腫瘍特異的な電気自動車をターゲットに液体生検は、治療応答のモニタリングを可能にするか、侵襲的処置6を必要とせずに、原発腫瘍を特徴付けるに役立つかもしれません。 確かに、電気自動車はすでに正常尿7、CSF 8、母乳9または血液10を含む様々な体液から単離されています。いくつかの研究は、異なるヒト疾患におけるEVの数と組成の変化を同定しました。例えば、敗血症患者にプロ凝固剤MVの数です大幅に健康な個体11と比較して増加しました。また、重度の脳マラリア患者において血中の総のMVの増加を観察することができ、血小板由来のMVの数は、コマの深さおよび血小板12と相関します。他の研究では、これが心血管イベント13,14のより高い確率と相関し、全身性エリテマトーデスまたは心不全患者で、後者の場合には内皮由来の小胞の上昇数を報告しています。 特に癌で、血液中の電気自動車は、現在、診断および予後値を有する新規バイオマーカーとして議論されています。このようなMUC1、EGFRまたはFAKなどの腫瘍関連タンパク質を発現するMVのレベルは、乳癌患者15,16の血液中で上昇しているように見えます。 EXOSために、最近の研究は、乳癌のための膵臓癌またはデル-1のためにそのようなグリピカン-1などの腫瘍特異的抗原を担持する血液由来EXOS早期疾患脱可能にすることもを示しました高い特異性と感度17,18とtection。さらに、血清由来の腫瘍EXOSは、治療予測19のためのそれらの使用を示唆しているKRASおよびp53のような突然変異の検出のために使用することができるDNAを含んでいてもよいです。最近の進歩は、特定のマイクロ流体チップを用いて、神経膠芽腫患者の血液中のEXOSの分析を示した治療20の監視を可能にします。まとめると、これらの知見は、小胞の疾患特異的亜集団の分析は、診断、予後だけでなく、治療の選択肢と成功についての貴重な情報を与えることを示唆しています。 しかし、血液からEXOSの単離および分析には時間がかかり、特殊な実験室装置を必要とし、したがって、まだ日常的な臨床診断のために適していません。対照的に、MVSははるかに高速に絶縁さと、それらのより大きなサイズにすることができ、容易に必要とすることなく、フローサイトメトリーによって分析することができる結合するそれらのラテックスビーズがEXOS 18のために必要であるように、21。したがって、ここでは、血液試料からのMVの標準化された単離およびフローサイトメトリーによるMV亜集団のその後の特徴付けのために使用することができるプロトコルを提示します。このプロトコルは、日常の臨床診断のためのMVを使用するために必要とされる大規模な患者群におけるさらなる研究とMVプロファイルの深さの特徴付けにできるようになります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

小さなエンドソーム由来のエキソソーム（EXOS、直径&lt;100 nm）を大型プラズマ膜由来微小胞（MVは、直径&gt; 100 nm）を含む細胞外小胞（電気自動車）のリリースにはすべての生きた細胞内で発生した基本的な細胞プロセスです。これらの小胞輸送タンパク質、脂質およびそれらの起源の細胞およびin vitro試験中の特定の核酸は、細胞間コミュニケーションのメディエーターとしてその重要性を強調しています。電気自動車が正常に様々な体液から単離されており、特に血液中の電気自動車は、癌または感染性疾患のためのバイオマーカーを約束として同定されています。血液中のMVの亜集団の研究を可能にするために、我々は、末梢血サンプルからのMVの標準化された単離および特徴付けのためのプロトコルを提示します。 MVが分画遠心分離によりEDTA抗凝固血漿試料からペレット化し、典型的には100の直径保有している - 600 nmのを。それらのより大きなサイズに、彼らがすることができます簡単にフローサイトメトリー、日常的にほとんどの研究室での臨床診断および利用可能に使用されている技術によって研究されます。孤立MVの品質管理アッセイのためのいくつかの例を説明すると、血液中の異なるMV亜集団を区別するために使用することができるマーカーが提示されます。

記載プロトコルに従って単離することができるMVの収量を定量化するために、我々は10人のドナーの血液サンプルから単離されたMVの量を計算しました。ローリー法で評価したMVの収率は、mLの血液あたり19.2μgのMVを（ 表1）の平均値と10の最大30μgの範囲でした。ナノ粒子追跡分析（NTA）によって決定される粒子濃度は、1.66×10 9からmLの血漿サンプルあたり5.9×10 9粒子（ 表2）の平均値で2.36×10 10でした。透過型電子顕微鏡によるMVのさらなる特徴は、脂質二重層に囲まれた、任意の細胞小器官（ 図1A）を含んでいなかった直径&gt; 100nm以下と小胞の集団を明らかにしました。 NTAは、単離されたMVのサイズは100から最大600 nmの（ 図1B）を範囲であり、平均MVサイズは201であることを確認しましたnmの（ 図1C）。ウェスタンブロッティングによる典型的なMVとエキソマーカーの染色はEXOSがチューブリン陰性であったとCD9およびCD81（ 図2）に富むながら孤立したMVは、チューブリンのために陽性であったとだけCD9とCD81のわずかな発現を示したことを実証しました。 フローサイトメトリー（ 図3A）によって単離されたMVの分析は、通常、細胞培養上清から単離されたMVのために使用したのと同じパラメータを使用してゲート制御することができる定義されたベシクル集団を明らかにし、それは、PBSの測定により得られたバックグラウンドシグナルとは明らかに異なっていました+ 1％のMV（ 図3B）を添加せずにFCSの小胞が枯渇します。血液中に存在する異なるMV集団を分析するために、のMVは、 例えば 、CD62P血小板由来のMVのために、CD45白血球由来のMVは、CD235a、異なる血液細胞集団について確立マーカーで染色しました内皮細胞由来のMVのための赤血球由来のMVとCD62E（ 図4）。この特徴付けは、MVの大部分は、全ての試料中の血小板によって流されるように見えた一方で、MV亜集団の割合は、調査したドナーの血液サンプル間で異なりことが示されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> 図1：末梢血から分離したMVのサイズ分布。 、単離されたMVは、透過型電子顕微鏡により可視化しました。 B、小胞のサイズ分布を示すMVの代表的なナノ粒子追跡分析（NTA）。 Cは、10の独立した調製物からの平均MVサイズはNTA（平均）で測定しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">アルをご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>この図のargerバージョン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> 図2： ウェスタンブロッティングによって単離されたMVのキャラクタリゼーション。 2人のドナーから単離されたMVおよびEXOSの示差タンパク質発現をウエスタンブロッティングにより可視化しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> 図3： フローサイトメトリーによるMVの分析。 、のMVは、まずそれぞれのMV集団に対してゲートにsidescatter（SSC）プロット対前方（FSC）で可視化されています。その後、これらのMVは、目的の抗原によるために特徴付けられています<html>抗原に対する蛍光標識抗体を用いました。 B、2人のドナーの血漿から単離さMVのためのSSCプロット対典型的なFSC。比較として、唯一のPBS + 1％ベシクル枯渇のMVなしFCSを用いた細胞培養上清、ならびに陰性対照から単離されたA549肺癌細胞由来の腫瘍細胞由来のMVのための典型的なプロットが右側に示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> 図4： フローサイトメトリーにより単離されたMVのキャラクタリゼーション。 3人のドナーからのMVは、フローサイトメトリーによって確立された血液細胞マーカー（赤）の発現について特徴付けました。それぞれのアイソタイプコントロールはグレーで表示されます。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白&quot;&gt; この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> MV / mLの血[μgの] </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> ＃3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> ＃4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> ＃5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> ＃6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> ＃7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> ＃8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> ＃9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> ＃10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> 表1：末梢血サンプルからのMVタンパク質収量。 </strオング&gt; 10ドナーから採取したmLの末梢血あたりのMVの量も示されています。 MV収率はローリーアッセイにより定量しました。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> MV / mLの血漿[粒子数] </td></tr><tr><td> ＃1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> ＃2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> ＃3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> ＃4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> ＃5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> ＃6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> ＃7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> ＃8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> ＃9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> ＃10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> 表2：末梢血サンプルからMV粒子収率。 </st&gt; MVの栄はナノ粒子追跡分析によって決定した10人のドナーと粒子数の血漿サンプルから単離しました。 3つの独立した測定値の平均値が示されています。

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

末梢血からの微小胞の単離とキャラクタリゼーション

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K ビュー.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

生物学

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA含有エキソソームの単離と解析

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

全血とバフィーコートからのヒト好中球の分離

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...