This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).

experiências em animais devem estar em conformidade com todas as normas governamentais e institucionais relevantes. 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Para a solução de hidrogel monómero (A4P0): Adiciona-se 20 g de acrilamida e 450 mL de 0,1 x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e ajustar o volume a 500 ml com 0,1 x PBS. CUIDADO: monómeros acrilamida são tóxicos. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório, luvas e sapatos fechados. <ol><li> Imediatamente antes de usar, adicionar 100 mg de 2,2&#39;-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propano] di-hidrocloreto a 40 mL de solução de monómero de hidrogel (A4P0) num tubo cónico de 50 mL sob uma coifa . </li></ol></li><li> Para a limpeza de tecidos electroforética (ETC) tampão: Adicionar 40 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) e 12,37 g de ácido bórico e 800 mL de H 2 O desionizada (dH2O). Ajustar o pH para 8,5 com NaOH e ajustar o volume para1 L com DH adicional de 2 O. CUIDADO: SDS é um produto químico prejudicial; portanto, lidar com isso com cuidado. </li><li> Para a solução CUBIC de montagem: Adicionar 250 g de sacarose, 125 g de ureia e 125 g de N, N, N &#39;, N&#39; -tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 150 ml de dH 2 O e perfazer o volume para 500 mL com dH2O </li></ol> 2. Preparação de amostras e Fixação <ol><li> Eutanásia do mouse. <ol><li> Prepara-se o alfaxalona (1 mg / kg) e xilazina (0,5 mg / kg) na mesma seringa. </li><li> Intraperitoneal injetar a mistura de alfaxalona e xilazina e permitir que 3 min para o mouse para se tornar inconsciente. </li><li> Espere até que o rato anestesiado já não responde a estímulos dolorosos, como uma pitada cauda, ​​antes de prosseguir. ATENÇÃO: Siga as orientações institucionais apropriados para a manipulação de animais. </li></ol></li><li> Transcardialmente perfundir o rato com 100 mL de NaCl a 0,9% (pH 7,4-7,5) solução decontendo heparina (100 U / mL) para desangrar, seguido por 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x (pH 7,4) 14. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A preparação da solução de PFA e todo o tratamento posterior deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li><li> Cortar a cabeça do rato, abrir a pele, e quebrar o crânio entre os olhos usando uma tesoura pequena. </li><li> Remover pedaços do crânio usando pequenas pinças, curvado. </li><li> Retire do cérebro ou órgãos desejados. </li><li> Incubar o cérebro e os órgãos em pós-fix solução PFA a 4% a 4 ° C durante a noite. NOTA: Para específica da região de compensação de tecidos, dissecar a região específica ou cortar o tecido após a fixação do tecido. CUIDADO: solução PFA é tóxico. A perfusão transcardial e todo o tratamento posterior do rato deve ser conduzida em um exaustor e com equipamento de protecção individual. </li></ol> 3. Hidrogel Monómero de infusão e Polymerization <ol><li> Incubar os órgãos fixos em solução hidrogel monómero A4P0 a 4 ° C durante 12-24 horas com agitação suave. </li><li> Hidrogel monómero-infundido polimerização tecido. <ol><li> Transfira a amostra para um tubo de fundo redondo de 10 mL com 5 mL de solução de monómero de hidrogel. Enrole a parte superior do tubo de fundo redondo com Parafilm. </li><li> Remover o oxigénio a partir do tubo de fundo redondo contendo o rato inteiro amostra infundidos cérebro-hidrogel fazendo borbulhar azoto através do líquido durante 1 minuto. De forma rápida e firmemente fechar o tubo contendo amostra. </li></ol></li><li> Transferir o tubo para um banho-maria (37 ° C) durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra polimerizada brevemente com 0,1 x PBS para remover o excesso de hidrogel. CUIDADO: monómeros de hidrogel são tóxicos. Para evitar o contato da pele com monômero de hidrogel, execute todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. NOTA: polimerizado tecidospode ser armazenada em 0,1X PBS contendo azida de sódio durante mais de 2 semanas a 4 ° C. CUIDADO: A azida sódica é altamente e altamente tóxico. Efectuar todos os procedimentos em um exaustor e com equipamento de protecção pessoal, incluindo um escudo de rosto, uma bata de laboratório e luvas. </li></ol> 4. eletroforética Tissue Clearing (ETC) <ol><li> Transferir a amostra polimerizada a um recipiente de tecido e colocar o recipiente na câmara de tecido, etc. </li><li> Encha a câmara ETC ETC com tampão usando a bomba peristatic. </li><li> Defina as condições ETC e executar o ETC. Use as seguintes configurações. <ol><li> Para configurações etc para órgãos inteiros, utilize as seguintes definições: (1,5 AMP), temperatura (37 ° C), hora (6,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li><li> Para configurações etc para grossas fatias de cérebro de rato de 1 a 2 mm, use as seguintes configurações: atual (1,5 amp), temperatura (37 ° C), hora (2,0 h), a velocidade da bomba (30 rpm) em execução. </li></ol></li><li> transferência tele limpou amostra para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de 0,1 x PBS. Lavam-se as amostras compensadas várias vezes com 0,1X PBS até não há bolhas são vistas quando o tubo é agitado brevemente (para confirmar a remoção completa do SDS). </li></ol> 5. imunomarcação de tecidos processados-ACT <ol><li> Para toda rato cérebro: incubar a amostra num volume de 3 mL de solução de anticorpo contendo 1x PBS, 6% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% de Triton X-100, e 0,01% de azida de sódio (solução de diluição do anticorpo) com uma diluição fator de 1/500 para a tirosina hidroxilase anticorpo (TH) durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Substituir a solução de anticorpo no final do dia 2. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 50 ml com 45 ml de 0,1 x PBS durante 3 - 5 h e mudar o tampão de cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 3 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário de burro anti-coelho de 488 durante 4 dias a 37 ° C com agitação suave. Replace as soluções anticorpo diluído no dia 2. </li></ol></li><li> Para a espessura 1- tecido cerebral cortado 2 mm: incubar a amostra durante a noite ou até um máximo de um dia, num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV a 37 ° C com agitação suave. <ol><li> Lava-se a amostra num tubo cónico de 15 mL com um volume de 12 ml de 0,1 x PBS durante 1-2 h. Alterar o buffer a cada hora. </li><li> Incubar a amostra num volume de 0,5 a 1 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para Cy3-conjugado de anticorpo secundário anti-coelho durante a noite ou até um máximo de 1 dia a 37 ° C com agitação suave. </li></ol></li><li> Lavar a amostra com 0,1 x PBS durante 3-5 h; mudar o tampão de cada hora. </li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. NOTA: </b&gt; 76 Tipo de anticorpos funcionou bem no tecido processado-ACT rato, incluindo 31 anticorpos monoclonais 14. Pré-tecido marcado pode ser combinado com a imunomarcação de mais dois fluorocromos no tecido ACT-processados. </li></ol> 6. imunomarcação de densas tecidos (Presto) <ol><li> c-PRESTO NOTA: c-PRESTO é adequado para pequenos porte amostras, tais como testículo inteiro, rim inteiro, ou pequenas seções de órgãos maiores. <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de 1,5 ml, adicionar 500 mL de uma solução de diluição de anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio tipo IV, e centrifuga-se o tubo a 600 × g durante 2 h. </li><li> Lava-se a amostra corada com 0,1 x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li><li> Adicionar 500 uL de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Cy3 e centrifugar a 600 x g durante 2 h. </li><li> Lavar a amostra corada com 0.1x PBS por centrifugação a 600 x g durante 30 min. </li></ol></li><li> s-PRESTO NOTA: s-PRESTO é adequado para tecidos maiores. <ol><li> Prepare uma seringa (volume de 30 mL) e conectá-lo a uma válvula de 3 vias (Figura 1A). Cole a válvula com uma pistola de cola para as condições de alta pressão (Figura 1B). </li><li> Transferir a amostra para a seringa conectada à válvula de 3 vias em a posição da válvula fechada. </li><li> Adicionar 5 - 7 ml de solução de diluição do anticorpo com um factor de diluição de 1/500 para o anticorpo de colagénio do tipo IV. Libertar a solução de anticorpo na amostra através da abertura da válvula. </li><li> Colocar o pistão da seringa para a posição de 17 mL para proporcionar espaço suficiente para o movimento infusão / retirada. Isto pode ser feito na posição da válvula aberta. Fechar a válvula de 3 vias, após a definição seringa está terminado. </li><li> Colocar a seringa que contém a amostra em uma bomba de seringa. Definir as condições de bomba de seringa a um volume de infusão / retirada de 10 ml / min e um 4-min tempo de pausa no modo de ciclo contínuo (Figura 1C). NOTA: A bomba infunde até atingir o volume alvo (10 ml), e, em seguida, a direção de fluxo de alterações após uma breve pausa (4 min). </li><li> Executar a bomba de seringa, durante 3 - 24 h à temperatura ambiente (Figura 1F). </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li><li> Lava-se a amostra corada duas vezes com 0,1 x PBS, durante 1 h cada vez usando a bomba de seringa. </li><li> Mudar com solução de diluição do anticorpo contendo anticorpo secundário anti-coelho Cy3 conjugada (factor de diluição de 1/500) e executar a bomba de seringa para 3-24 h. </li><li> Abra a válvula de 3 vias e substituir a solução com 0,1 x PBS. </li></ol></li><li> Antes de imagiologia, incubar a amostra manchado em uma quantidade adequada de solução de montagem cúbico por 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. Substitua com uma solução CUBIC-mount fresco e incubar durante mais 1 h. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Coloque o tecido marcado em um prato confocal e adicionar solução CUBIC de montagem até que o tecido é coberto. Coloque uma lamela sobre o tecido. Use um microscópio confocal para a imagem do tecido 14 sob a objetiva de 10X. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Má fixação ou a imersão do hidrogel em tecidos pode causar a perda de proteínas e a distorção do tecido durante o processo de limpeza do tecido. Todo o cérebro do rato adulto deve ser incubada em paraformaldeído a 4% durante a noite, seguido por imersão num volume mínimo de 20 mL de solução de monómero de hidrogel para 12 - 18 h com agitação suave. Para grandes tecidos, incluindo tecidos de origem humana, tais como fatias de cérebro e medula espinal, estendido imersão tempo na solução de monómero de hidrogel é necessária. O protocolo ACT é facilmente aplicável à limpeza de tecidos fixos porque os passos de fixação de tecido e de infusão de polímero são separados. Depois de limpa de tecido, tecidos humanos foram bem coradas com vários anticorpos. Note-se que a técnica ACT compensação não é compatível com fixadores álcool, tal como etanol e metanol. A etapa de polimerização tecido-hidrogel também é fundamental para a produção de tecidos de boa qualidade no seguimento do processo de compensação. Porqueo oxigénio inibe a polimerização de acrilamida, que deve ser removido por desgaseificação a solução contendo o tecido sob um sistema de infusão de azoto gasoso. Alternativamente, DE-oxigenação pode ser executado usando uma câmara de vácuo com um bloco de aquecimento durante 23 h. A taxa de compensação é dependente de vários fatores, incluindo o tamanho do órgão, o conteúdo de lipídios ou proteínas fibrosas ECM, a condição de fixação, etc. A maioria dos tecidos do rato adulto pode ser afastada pelo ETC durante a noite. No entanto, há um risco desnecessário de sobre-compensação e inchaço dos tecidos; Assim, as diferenças de tempo de compensação são de consideração importante. condições tecido de limpeza deve ser determinada empiricamente. Mais importante, o conteúdo da ECM podem afectar a aparência do tecido limpo. A cor dos tecidos permanece branca ou opaca, mesmo após a ACT em tampão ETC, porque ACT não limpa fibras de proteína densas. No entanto, quando estes órgãos foram imersos em solução correspondente RI, oy se tornou transparente. A taxa de inchamento dos tecidos parece ser dependente do conteúdo de ECM os tecidos e órgãos moles, tais como o cérebro, exibem uma proporção de inchaço superior a órgãos densas. Porque o aumento do inchaço dos tecidos vai ajudar o processo de tecido-clearing, ACT rotineiramente utiliza destilada tampão à base de água na maioria dos casos. Em alguns casos, quando o inchaço dos tecidos ou deformidade transitória não é desejável, tais como em embriões, tampão contendo 0,1 x PBS pode ser aplicada para imagens de alta resolução. Deve-se também notar-se que as concentrações mais elevadas de sal no tampão poderia causar o encolhimento dos tecidos. O método ACT pode esclarecer órgãos inteiros e até mesmo todo o corpo de um rato 14. No entanto, processamento de imagem de tecidos profundos de tecido transparente exige microscópios e objetivos especiais. Assim, o tecido cerebral de 1 a 2 mm de espessura é mais eficaz para imagiologia com um microscópio confocal convencional. Nas nossas mãos, a remoção da etiquetaanticorpos ed dos tecidos processados-ACT é dependente de anticorpos, e rodadas de rotulagem anticorpo diferente não são recomendados. Vários anticorpos, como TH e GFAP, trabalhou especialmente bem para todo o cérebro immunolabeling 14. Por outro lado, alguns anticorpos, tais como TuJ1 ou Map2, frequentemente marcado apenas a superfície dos tecidos. Isto pode ser melhorado por outros métodos, tais como o interruptor 15. Outra limitação potencial é que pode ser difícil para preservar estruturas de proteínas finas no tecido processado-ACT devido ao inchaço dos tecidos e encolhimento durante a etapa de remoção de tecido. A técnica presto é aplicável a uma grande variedade de técnicas de rotulagem tecido. Por exemplo, em métodos de tecido transparente usando tecido pré-marcada, como SeeDB 4 e 7 iDISCO, imunomarcação de tecido denso requer períodos de incubação mais longos do que alguns dias a semanas. No entanto, Presto pode encurtar o tempo de incubação a várias horas, enabling a realização de todo o processo dentro de um dia, com 1 mm de espessura de tecido denso. PRESTO pode melhorar a eficácia de deep-rotulagem de espessura, tecidos densos, ou tecidos grossos mesmo un-desmatadas. Porque Presto utiliza uma centrífuga de mesa ou bomba de seringa e não requer qualquer equipamento especial, é relativamente fácil de implementar esta técnica com os procedimentos laboratoriais de rotina.

Um dos desafios da neurociência é a visualização de fiação do circuito neuronal e as células individuais dentro do tecido cerebral intacto. Até recentemente, demonstrando as conexões entre os neurônios desta forma necessária 1) cortes seriados de tecidos; 2) rotulagem molecular de alvos específicos, como axônios ou proteínas; e 3) a visualização de reconstrução 3D de todo o cérebro através de registro computacional ou o alinhamento das imagens em série 2D 1. Estes passos são trabalhoso, requer uma grande quantidade de tempo, e são susceptíveis de perder informações durante o corte e rotulagem, fazendo o mapeamento de rede neuronal extremamente difícil. No entanto, muitos métodos que permitem a visualização de tecido intacto, sem corte têm sido desenvolvidos. Os tecidos biológicos pode ser feita opticamente transparente por meio de técnicas de limpeza de tecido 2-10. Um dos principais métodos é reduzir as diferenças do índice de refracção entre o tecido intacto e a solução de imersão em ordempara reduzir a dispersão da luz no tecido intacto, tornando assim o tecido transparente e permitindo a observação de estruturas profundas. Alguns tipos de soluções de imersão tem propriedades hidrofóbicas, o que resulta na rápida paragem da fluorescência durante o processo de desidratação. Por conseguinte, estes métodos não são compatíveis com imagens fluorescentes ao longo de um longo período de tempo de 11,12. Em vez de reagentes hidrofóbicas, outros métodos utilizam reagentes hidrofílicos para limpeza de tecidos, tais como SeeDB 4 e Sca l e 6, que mantêm a informação estrutural e de fluorescência do 4,6,8 tecido biológico. Contudo, macromoléculas, incluindo anticorpos, podem não alcançar o núcleo de tecido intacto por difusão por si só. Portanto, a pré-marcação de moléculas alvo em áreas profundas de tecidos densamente-embalados é tecnicamente desafiador. Num método tecido desobstrução-recentemente desenvolvidos, Clareza 3, um i de tecido biológico embebido em hidrogels formados com acrilamida, e os lípidos são removidos por electroforese sob sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a solução molecular contendo. A amostra é então imerso numa solução com um índice de reflexão correspondente para reduzir a luz de espalhamento 3. O sistema de remoção de lípidos foi posteriormente modificada em clareza avançada 13 e PACT (técnica de clareza passiva) 10. Após a polimerização, as cadeias de ligação cruzada com proteínas de acrilamida, formando hidrogel-tecido. componentes lipídicos pode não reticulam com acrilamida; Assim, os lípidos podem ser eliminados por electroforese sob o tampão contendo SDS. Através da eliminação ativa de lipídios, o tecido cerebral aumenta acentuadamente em transparência 9. No entanto, estes métodos não abordam a impossibilidade de deep-rotulagem por difusão livre. Para superar essa limitação, técnicas para o transporte ativo de reagentes para as partes mais profundas de tecidos grossos são necessários. Embora CLAREZA permite compensação de tecido e tecido-fundovisualização, não é um processo fácil ou rápido. Ele pode levar várias semanas para limpar a 7,14 cérebro do rato inteiro. compensação rápida dos tecidos é essencial para a aplicação de tais métodos para definições básicas ou clínicas laboratoriais para pesquisa de ciências biológicas ou diagnóstico volume. O protocolo atual fornece um processo simplificado para apuramento tecido biológico e detecção da proteína subsequente mediante a entrega de imuno-coloração assistida por pressão. É apropriado para a formação de imagens espaciais de alta resolução de sistemas de processamento de dados arquivados grandes e 3D através da combinação com métodos de imagem.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Lugen SCI&amp;nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>sample fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2&amp;rsquo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VA-044</td><td>Hydrogel monomer solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide pellets</td><td>Junsei chemical</td><td>1310-73-2</td><td>ETC buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323A</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Immunolabeling</td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH)</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>Antibody/immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td>Secondary antibody/ immunolabeling</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Junsei chemical</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC-mount solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECT chamber</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>ECT chamber controller</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Temperature probe</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristatic pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Buffer reservoir</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tissue container&amp;nbsp;</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12001</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Container holder for 1 tissue container</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Mouse brain slice holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12004</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Whole rat brain holder</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC system</td></tr><tr><td>Tabletop-centrifuge</td><td>Hanil science industrial Co., Ltd</td><td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Baoding longer precision pump Co., Ltd</td><td>LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>Syringe (30 mL)</td><td>Korea vaccine Co., Ltd.</td><td>KV-S30</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Hyupsung medical Co.,Ltd.</td><td>HS-T-01N</td><td>s-PRESTO</td></tr></tbody></table>

act-presto: biological tissue clearing and immunolabeling methods for volume imaging

A identificação e exploração da organização detalhada de órgãos ou de todo o corpo no nível celular são desafios fundamentais da biologia. métodos de transição requerem uma quantidade substancial de tempo e esforço para obter uma imagem 3D e incluindo o seccionamento do tecido intacto, imunomarcação e imagiologia do tecido em série em corte, o que produz uma perda de informação em cada passo do processo. Em abordagens recentemente desenvolvidas para imagens de alta resolução dentro do tecido intacto, caracterização molecular foi restringido à rotulagem de proteínas. No entanto, os protocolos disponíveis atualmente para compensação de órgãos exigem um tempo de processo consideravelmente longo, tornando-se difícil de implementar técnicas de limpeza de tecidos em laboratório. Recentemente, estabeleceu um protocolo rápido e altamente reprodutível denominado ACT-PRESTO (a ctive c laridade t echnique- p ressão r exultante e ficiente e s tabela t ransferênciade macromoléculas para o rgans), o que permite o afastamento do tecido dentro de várias horas. Além disso, ACT-PRESTO permite imunomarcação rápida com os métodos convencionais e acelera a penetração de anticorpos na camada profunda da densamente formados espécimes, de espessura através da aplicação de fluxo de pressão ou convecção. Nós descrevem como preparar tecidos, como limpar pela remoção de lipídios usando eletroforese, e como imuno-mancha por um parto assistido à pressão. A rapidez e consistência do protocolo irá acelerar o desempenho da investigação histológica 3D e diagnósticos baseados no volume.

Clearing ACT-tecidos Um fator importante que afeta a compensação de tecidos é a fixação do tecido. PFA fixação e infusão de acrilamida são etapas separadas neste protocolo. Depois do passo de polimerização do tecido de hidrogel, a solução A4P0 livre não é polimerizado, apesar de infusão de tecido hidrogéis são reticulados com macromoléculas endógenas. Portanto, não deve formar gel de fora do tecido (Figura 2A). O procedimento ACT resulta em menos reticulação entre as proteínas e acrilamida em comparação com o protocolo de clareza. Assim, a amostra de tecido de hidrogel é mais porosa. Este recurso permite a extração rápida de lipídios e a difusão de macromoléculas. As secções de cérebro de rato de 1 a 2 mm de espessura foram suficientemente afastada dentro de 1 - 2 horas (Figura 2B), e 5-6 h de etc foi suficiente para Clearance de cérebros inteiros de rato (Figura 2C). compensação de tecido mediada por Hidrogel induziu a expansão do tecido depois do passo etc, mas o tecido devolvido ao seu tamanho original, em solução pareados por índice de reflexão. A amostra de tecido de hidrogel formado no procedimento ACT é altamente porosa, e, assim, compostos pequenos e macromoléculas poderia penetrar eficientemente e difundir facilmente (Figura 3). Após 2 h de incubação de fatias de cérebro de 1 mm com tirosina-hidroxilase (TH) e o anticorpo de tipo IV do colagénio, uma subsequente de 2 horas de incubação com um anticorpo secundário era suficiente para rotular os neurónios dopaminérgicos, a uma profundidade de 500 um (Figura 3) . Imunomarcação PRESTO-tecidos órgãos densas têm, geralmente, concentrações elevadas de fibras de ECM, que afecta a penetração dos anticorpos para os tecidos. Assim, os anticorpos Penetavaliaram a uma profundidade de apenas 20-30 uM em tecidos densos, tais como o tecido renal, após 12 h de incubação. Para superar esta limitação, desenvolvemos métodos de penetração de macromoléculas activas que permitem a entrega de reagentes para os tecidos profundos, isto é, presto (pressão relacionada com a transmissão estável e eficiente de macromoléculas para os órgãos) (Figura 4). Em comparação com a incubação estática de tecido renal processado-ACT com soluções de anticorpos, a aplicação de forças centrífugas (600 xg) com uma centrífuga de mesa (PRESTO centrífuga, c-PRESTO) melhorou muito a entrega de anticorpos no tecido profundo (Figura 5). Quando aplicamos o procedimento c-PRESTO aos tecidos densos, 3 h de incubação foi suficiente para rotular 250 para estruturas profundas 300 mícrons. Para melhorar a distorção do tecido, sem dano tecidual significativa, que também projetou uma máquina que fornece fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO). Este processo igualmente melhorada pe de anticorposnetration comparada à difusão passiva (Figura 5). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação do aparelho s-presto. A. Uma seringa (30 mL) e torneira de três vias. B. A torneira de três vias conectada e colada à seringa. C. A seringa contendo a solução de amostra e o anticorpo, e a seringa colocada sobre a bomba de seringa. D. A bomba de seringa e configuração de condição de trabalho. E. A bomba de infusão de um solução contendo os reagentes de marcação para o espécime. Quando o volume designado é atingido, as mudanças de direcção de bombagem e se retira a solução após um período de tempo designado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. ACT compensação tecido do cérebro de rato. A. Após a polimerização, as soluções A4P0 livres não são polimerizados; hidrogeles infusão de tecido são gelificado por reticulação com macromoléculas endógenas. B. 1 a fatias de cérebro de espessura de 2 mm foram apuradas para 1 - 2 h, e o grau de expansão e recuperação de tamanho em índice de reflexão (RI) solução -Correspondência foram registrados. C. A espessura de todo o cérebro do rato é de cerca de 0,8 cm e 5-6 h da ETC foi suficiente para limpar completamente o cérebro. Após 3 h de ETC, houve uma quantidade significativa de tecido não apagada. Por 6 h de ETC, no entanto, havia ocorrido compensação de todo o cérebro. A cor dos tecidos após ACT no buffer ETC é branca ou opaca. Pelo ajuste RI, os tecidos tornam-se transparentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique dela</a>e para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg" /> Figura 3. imunomarcação com tecido cerebral do rato limpou-ACT. Imagens de 1 mm fatias processadas-ACT cérebro do rato mostrando córtex cerebral do rato corado com um anticorpo para colágeno tipo IV e parte do mesencéfalo coradas com um anticorpo para tirosina hidroxilase (TH). barra de escala, 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg" /> Figura métodos imunomarcação 4. PRESTO. Os anticorpos não conseguem penetrar em tecidos densos por difusão. métodos PRESTO imunomarcação foram projetados para infundir ativamente macromoléculas e entregar reagentes paratecidos densos. A aplicação de forças centrífugas, usando uma centrífuga de bancada padrão (Presto centrífuga, c-Presto) nitidamente facilitada a entrega de anticorpos. A aplicação de fluxo de convecção com uma bomba de seringa (PRESTO seringa, s-PRESTO) melhorou a penetração do anticorpo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg" /> Figura 5. PRESTO imunomarcação de tecido denso limpou-ACT. Para C-Presto, os tecidos foram centrifugadas a 600 xg durante 3 h, usando uma centrífuga de bancada padrão, a fim de acelerar a penetração dos anticorpos primários e secundários. Para S-Presto, uma bomba de seringa foi utilizado para entregar os anticorpos. órgãos do rato, tais como os rins e do fígado, foram marcadas com colagénio de tipo IV. Comparado com os métodos convencionais, 3 h deC ou S-PRESTO marcadamente aumenta a profundidade rotulagem. No rim e fígado, a profundidade do eixo Z atinge 300-350 uM ou mais profundo em amostras presto (à direita), enquanto as amostras de controlo são rotulados a uma profundidade de apenas 40 - 50 | iM (esquerda). A imagem reconstruída 3D foi obtida com um microscópio confocal. barra de escala, 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

act-presto-biological-tissue-clearing-immunolabeling-methods-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K visualizações.  Korea University College of Medicine.  ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada. 

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neurociência

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Medicina

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Imagem e quantificação de dendritos neuronais intactos via clareza de tecido

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Reconstrução 3D de alta resolução do cérebro humano com SHORT e LSFM

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

Autor em destaque: Avançando na análise de citoarquitetura 3D - Reconstrução volumétrica rápida do cérebro humano 

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.