We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparação de larvas <ol><li> Uma semana antes de gravar comportamento, configurar uma cruz (mínimo de 25 virgens e 5 machos). Manter todos os cruzamentos e filhos a 25 ° C. NOTA: A temperatura de condições de cultura pode ser alterado, mas a linha de tempo descrito abaixo iria necessitar de ser ajustada para considerar as alterações na velocidade de desenvolvimento. </li><li> 5 dias antes da gravação, a primeira coisa na parte da manhã, colocar a cruz em uma gaiola coleção com uma tampa de agar / suco e um dab (0,5-1 ml) de pasta de levedura no centro da tampa agar / suco. <ol><li> Para fazer uma gaiola de recolha, criar buracos em um 6 oz. polietileno quadrado garrafa de Drosophila. </li><li> Para fazer tampões de agar / suco, misturar 18 g de agar com água de 600 ml num balão de Erlenmeyer. Em um separado frasco de mistura de 20 g de sacarose com 200 ml de suco de maçã. Micro-ondas até os sólidos estarem dissolvidos. Combinar e agita-se, permitindo que a mistura arrefecer até 60 ° C. Adiciona-se 20 ml de 10% de metil-p-hidroxibenzoato de metilo em 95% de etanol, e agita-se. Adicionar ~ 7ml para a metade inferior de uma placa de Petri rodada 35 x 10 mm. Permitir ágar / suco a solidificar durante 1 h à TA. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Para fazer a pasta de levedura, adicione partes iguais em volume de fermento seco e água. Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Verifique a saúde das coleções de larvas. <ol><li> Na parte da manhã, 4 e 3 dias antes da gravação, retire a tampa e coloque uma nova tampa na gaiola. Mudar as tampas, ao mesmo tempo todos os dias para obter uma coleção de 24 horas de ovos e larvas recém-nascidas. </li><li> Depois de cada tampa é removida, examiná-lo para ver quantos ovos cruz está colocando. Esperar entre 500-2.000 ovos. Ajustar o número de adultos, se necessário. NOTA: Alguns ovos devem ter eclodido em larvas, e as larvas recém-eclodidas será encontrada longe da pasta de levedura. </li><li> Envelhecemos cada tampa, durante 24 horas. Re-examinar a tampa para determinar se as larvas são saudáveis. NOTA: A maioria dos ovos deveriam ter chocado em larvas, e as larvas devem ter rastejado para o yepaste ast. Os sinais de má saúde incluem um grande número de ovos não eclodidos, corpos de larvas mortas distância da pasta de levedura, e larvas com manchas escuras significativas no abdómen, indicando uma reacção imunitária. Se as larvas são insalubres, mudar a gaiola, fazer tampas frescas / colar fermento, e verificar o genótipo. </li><li> Descartar as velhas caps. </li></ol></li><li> Recolha larvas para gravações comportamentais. <ol><li> Em ambos os dias 2 e 1 antes da gravação, retire a tampa e substituir com uma tampa fresca. </li><li> Etiquetar cada tampa retirada e manter a 25 ° C. Isto irá produzir uma série encenado de larvas para gravações comportamentais. Larvas de recém eclodidos (0-4 h pós-eclosão) através de segunda instar (24-48 h pós-eclosão) pode ser usado nos canais. Salve tampas para gravações em dias consecutivos. </li><li> Descarte todos os tampões depois de 48 horas. </li><li> Se necessário, repita os passos 1.4.1-1.4.3 para até 5 d adicional. Depois que menos ovos fertilizados são produzidos. </li></ol></li></ol><ol><li> Prepare os PDMS canal lineares (polidimetilsiloxano, um elastômero de silicone) molde de fundição (Figura 1A). PDMS moldes de fundição estão disponíveis a partir do laboratório de Heckscher mediante pedido. <ol><li> Limpar o molde de fundição com álcool isopropílico. Ar seco, seque com toalhetes de laboratório ou use ar comprimido. </li><li> Coloque o molde de fundição num prato de 10 centímetros tampa de Petri ou outro recipiente. </li></ol></li><li> Prepare e despeje solução de agarose. <ol><li> Adicione uma solução de 3% de agarose em água (3 g em 100 ml) por microondas até estarem completamente dissolvidos. </li><li> Arrefecer até 55 ° C, permitindo que as bolhas sobem para a superfície. </li><li> Verter a mistura de agarose em placa de petri contendo o molde de fundição de modo a que o molde é apenas coberto. Vamos conjunto de agarose até que solidificou. </li></ol></li><li> Remover os canais de agarose a partir do molde de fundição. Apara as bordas do disco de agarose com uma lâmina de barbear. <ol><li> Coloque o canals em uma placa de Petri de 10 centímetros imerso em água. Eles podem ser mantidas a 4 ° C durante 7 dias. </li></ol></li></ol> 3. Colocar um Larva em um canal para registrar o comportamento NOTA: Se canais de armazenamento a 4 ° C, permitem que os canais para chegar até à temperatura ambiente antes de o utilizar para a gravação do comportamento. <ol><li> Usar uma lâmina de barbear para cortar limpo num único canal daqueles preparado no Passo 2 (Figura 2A). </li><li> Use uma pinça para colocar o canal sulcado-side-up em uma lamela de vidro (Figura 2B). O tamanho e espessura da lamela depende do âmbito específico usado para a imagem latente. </li><li> Utilize uma pinça fina para seleccionar uma larva do tampão de agar / suco preparada no Passo 1 e colocar no canal de corte (Figura 2C). <ol><li> Não aperte a larva. Buscá-lo suavemente com a ponta do dente fórceps. É também possível manipular a larva com um pincel com uma ponta fina. NOTA: Isto é importante porque as larvas são muito sensitive ao toque. Se eles não forem manuseados com cuidado, as respostas nociceptivas pode dominar o seu comportamento durante os primeiros segundos do experimento. </li><li> Lavar as larvas, submergindo-os rapidamente em água. </li><li> Depois de colocar a larva para o canal de corte, use a ponta do dente pinça para provocar suavemente a larva no bosque canal. NOTA: Para a maioria das aplicações, a largura da larva e a largura do canal deve corresponder. A largura média das larvas em diferentes fases de desenvolvimento a seguir: 0 h pós-eclosão - 140 um, 24 h pós-eclosão - 180 um, 48 h pós-eclosão - 320 uM, 72 h pós-eclosão - 500 mm, 96 h pós-eclosão - 750 uM 8. Canais entram nas seguintes larguras: 100, 150, 200, 250 e 300 um, e todos os canais são de 150 um de profundidade. </li><li> Utilize a ponta de um dente ou de uma pinça pincel para ajustar a posição da larva no interior do canal. Ele pode ser orientado em qualquer direcção: ventral-se, ventral para baixo, ventral para um lado, dependendo do que a estrutura está a ser trabalhada. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça, levante o canal ao longo de modo que a larva está agora na tampa de vidro. Coloque uma ou duas gotas de água nas extremidades do canal para que ele se enche de água (Figura 2D). <ol><li> Suavemente levantar os lados do canal para remover quaisquer bolhas de ar. </li><li> Ajustar a orientação da larva. Para fazê-lo, gentilmente cutucar o canal, mas não a tampa de vidro para rolar a larva. Se isso não mudar a orientação, remova a tampa de vidro e ajustar a posição larval. A larva está pronta para ser trabalhada. </li><li> Imagem do canal / lamela em um microscópio invertido. Se imagens em um microscópio vertical, basta inverter o canal / lamela. </li></ol></li></ol> 4. Meça Característica de Participação na gravação Behavioral <ol><li> Para uma estrutura de interesse (por exemplo, cauda, CNS), medir uma característica de interesse (por exemplo,, A intensidade de fluorescência, localização) ao longo do tempo. NOTA: Estruturas como a cabeça ea cauda podem ser anotados manualmente. Por exemplo, a cabeça pode ser identificado como contendo ganchos em forma de H boca escura, e a cauda podem ser identificadas como contendo spiricles traqueal posterior. Este artigo centra-se no cordão nervoso. Utilizar a linha de GAL4 elav-GAL4 neuronal para conduzir um transgene-UAS-GFP MYR (elav&gt; GFP) 9,10 fluorescente para rotular o sistema nervoso central (SNC). O SNC contém dois lobos cerebrais anteriores ligados ao cordão nervoso, que se prolonga para a parte posterior (Figura 3). </li><li> Medir a intensidade de pixel do cordão nervoso (F (NC)) em cada ponto de tempo (t). Abaixo descreve uma abordagem anotação manual, mas este passo pode ser automatizado. <ol><li> Em Fiji (ou software similar) no menu &quot;Analisar&quot; usar o &quot;Definir Medidas ...&quot; caixa de diálogo para relatar o valor de cinza média e slice posição. </li><li> Desenhar manualmente uma caixa no centro do cordão nervoso no primeiro quadro do filme (Figura 3). Esta etapa também pode ser automatizada com segmentação de imagem e de registro algoritmos. </li><li> Use o comando &quot;Measure&quot; no menu &quot;Analisar&quot; para relatar a intensidade média dos pixels na região encaixotado de interesse. Isso gera uma janela &quot;Resultados&quot;. </li><li> No próximo quadro, reposicionar manualmente a caixa sem redimensionar usando as teclas de seta. Use o comando &quot;Measure&quot; novamente. Os resultados atualizados serão mostrados no &quot;Resultados&quot; janela. Repita este passo para cada quadro de interesse. </li><li> Salvar os &quot;Resultados&quot; usando o &#39;Salvar como ...&#39; comando no menu Arquivo. Os resultados serão exportados como um arquivo .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analisar as Medidas <ol><li> Normalizar cada valor F (NC) para um valor entre 0 e 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> Na planilha (ou outro programa), abra o arquivo Results.xls. Este arquivo terá duas colunas que representam o número do quadro e intensidade média de fluorescência. </li><li> Fazer uma nova coluna e usar a fórmula Z (t) = f (NC [T]) min (F [NC]) / max (f [NC]) min (F [NC]) para gerar um valor de fluorescência normalizada correspondendo a cada ponto de tempo. </li></ol></li><li> Determinar o período passo para cada passo na gravação. NOTA: Um ciclo passo é a unidade de toda repetitivo movimento do corpo para a frente (e reverso) rastreamento. Por convenção atacante começa stride (e termina) com o movimento de avanço da cauda, cabeça e outros órgãos internos, como o intestino ou CNS 1. <ol><li> Inspecionar manualmente a gravação comportamental e registrar os tempos de iniciação (i) de cada passo (i (Stride Ciclo [n])). NOTA: No exemplo abaixo, o movimento para a frentedo sistema nervoso central como o início de um ciclo do passo foi utilizado (Figura 3). </li><li> Para cada passo calcular o período: Δ t (ciclo Stride) = i (Stride Ciclo [n + 1]) -i (Stride Ciclo [n]). </li></ol></li><li> Calcular percentagem de ciclo de passo decorrido para cada ponto de tempo da gravação. <ol><li> Realizar uma coluna adicional no ficheiro de folha de cálculo que representa o tempo decorrido desde o início de um ciclo do passo (c). Tempo definido desde a iniciação passo a zero no início de cada passo (c (Stride Ciclo [n]) = 0). Ajustar os tempos após a iniciação em conformidade. </li><li> Faça uma coluna adicional no arquivo de planilha que representa ciclo cento passo decorrido (% ciclo de stride) Divida vezes ajustados pelo período passo e multiplicar por 100 para converter a porcentagem do ciclo da passada decorrido:. Ciclo% stride = (c (Stride Ciclo [n] )) / (T Δ (Ciclo Stride) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Gerar Coordenadas Polares Terrenos para representar dinâmica das estruturas de interesse ao longo do ciclo de rastreamento <ol><li> No MATLAB, use o diálogo o &quot;Importação de dados&quot;, na guia Início para importar o Results.xls atualizado. </li><li> Faça uma nova matriz &quot;Teta&quot; valores do ciclo da passada contendo por cento (% ciclo da passada). ( &quot;Theta = Var1&quot;, onde Var1 representa% do ciclo da passada). </li><li> Faça uma nova matriz &quot;Rho&quot; contêm valores de fluorescência normalizada (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot;, onde Var2 representa z (t)). </li><li> Use o comando &#39;polarplot&#39; para fazer coordenadas polares parcelas com o ciclo cento passo como o ângulo, e a fluorescência como o raio ( &quot;polarplot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Um dispositivo de microfluidos foi construído para fazer canais de agarose lineares que podem acomodar as larvas de Drosophila (Figura 1). Quando as larvas de Drosophila são colocados nestes canais de agarose lineares seu repertório comportamental é limitada para o rastreamento, o qual permite a observação detalhada da dinâmica de estruturas larvais ao longo do ciclo de rastreio. Uma gravação bem sucedida quando ocorre uma larva de executar uma sé...

O objetivo geral deste método é estudar Drosophila rastreamento larval em detalhe. Experimentos em locomoção têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias sobre o controle motor 2. Tradicionalmente locomoção foi estudado em animais aquáticos (por exemplo, sanguessuga, lampreia, girino) 3. A natureza repetitiva de locomoção nestes animais foi permitido para o estudo de rhythmogenesis, para análise dos eventos biofísicas locomoção de condução, e para monitorizar os padrões de disparo neurais que acompanham a locomoção. O uso de larvas de Drosophila para estudos de locomoção apresenta uma combinação única de vantagens sobre outros sistemas modelo: genética fáceis, o desenvolvimento bem caracterizada, um corpo que é opticamente clara no primeiro e segundo estádios e uma reconstrução de microscopia eletrônica de transmissão contínua de toda a sistema nervoso 4-6. No entanto, Drosophila larval locomovimento sobre superfícies planas e abertas é um pouco complexo, incluindo pausas, voltas, e sinuoso rasteja 7. Esta publicação apresenta um método para usar os canais de agarose lineares para guiar o comportamento locomotor larval Drosophila tal que larvas executar sustentado, comportamento de rastreamento em linha reta, rítmica. Estudando o comportamento das larvas de Drosophila em canais de agarose, em vez de comportamento sobre superfícies planas e abertas, tem várias vantagens. Primeiro, ele permite que os pesquisadores para selecionar especificamente rastejando comportamento dos muitos movimentos que fazem parte do repertório comportamental larval. Em segundo lugar, ajustando a largura do canal em relação ao tamanho do corpo das larvas, rastejando velocidade pode ser ajustada. Em terceiro lugar, os canais para permitir que a larva para ser visto a partir dorsal, ventral, ou lateral, dependendo de como a larva é carregado e orientada no interior do canal. Esta versatilidade na orientação das larvas permite a qualquer estrutura de interesse a ser continuamente visível durante o rastreamento. Quarto,canais são passíveis de utilização com uma vasta variedade de microscópios e objectivos. Por exemplo, os canais lineares pode ser usado para geração de imagens de baixa resolução em stereoscopes de campo brilhante e / ou para imagens de alta resolução sobre a fiação de disco microscópios confocal 1. Em quinto lugar, este método pode ser usado em combinação com manipulações neuronais optogenetic / termogênico em todo o fundo genético. Finalmente, porque tanto o corpo larval (em primeiro e segundo estádios) e canais de agarose são opticamente clara, canais podem ser usados ​​quando se estuda os movimentos dinâmicos, ou mudanças na intensidade da fluorescência das estruturas larval rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados. O método descrito é apropriado para estudos cinemáticos detalhadas de primeiro e segundo instar Drosophila comportamento larval. Esta publicação analisa as mudanças dinâmicas na intensidade de fluorescência do CNS durante o rastreamento larval para a frente para demonstrar o uso de canais e como um precursor para NeuImagem de cálcio ronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila rastreamento larval está emergindo como um modelo poderoso para estudar controle neural do comportamento sensório-motor. No entanto, comportamento de rastreamento larval em superfícies planas e abertas é complexo, incluindo: pausa, girando, e sinuoso. Esta complexidade no repertório do movimento dificulta uma análise detalhada dos eventos que ocorrem durante um único ciclo de rastreamento passo. Para superar esse obstáculo, os canais de agarose lineares foram feitas, que restringem o comportamento das larvas para, sustentada, rastreamento rítmica reta. Em princípio, pois os canais de agarose e o corpo de larvas de Drosophila são ambos opticamente clara, o movimento das estruturas de larvas rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados podem ser monitorizadas em larvas intacta, livremente em movimento. No passado, as larvas foram colocados em canais lineares e rastejando ao nível do organismo inteiro, segmento, e músculo foram analisados 1. No futuro, as larvas rastejar nos canais podem ser usados ​​para imagiologia de cálcio para monitorar neuroatividade nal. Além disso, estes métodos podem ser utilizados com larvas de qualquer genótipo e com qualquer canal concebido-investigador. Assim, o protocolo apresentado abaixo é amplamente aplicável para estudos utilizando a larva de Drosophila como um modelo para compreender o controlo do motor.

Este artigo descreve um método para guiar o comportamento da larva de Drosophila usando canais de agarose e para medir a dinâmica das estruturas larvais ao longo de um ciclo de rastreamento. Larvas em canais lineares executar ataques sustentados de rastreamento rítmica (Figura 3). Uma vez que tanto as larvas e os canais são opticamente transparentes, os canais podem ser usados ​​com larvas expressando sondas fluorescentes expressas em qualquer estrutura ...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

A larva Drosophila é um sistema poderoso modelo para estudar o controle neural do comportamento. Esta publicação descreve o uso de canais de agarose lineares para provocar surtos sustentados de rastreamento e métodos linear para quantificar a dinâmica das estruturas de larvas durante o comportamento rastejando repetitivo.

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K visualizações.  University of Chicago.  A larva Drosophila é um sistema poderoso modelo para estudar o controle neural do comportamento. Esta publicação descreve o uso de canais de agarose lineares para provocar surtos sustentados de rastreamento e métodos linear para quantificar a dinâmica das estruturas de larvas durante o comportamento rastejando repetitivo. 

Vídeo: Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Ensaios para detectar estruturas de reflexão de UV e determinar a sua importância na preferência do companheiro usando o Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo

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Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3^Rd Instar Drosophila Preparações larval

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em

Imagens ao vivo de

Ensaios para detectar estruturas de reflexão de UV e determinar a sua importância na preferência do companheiro usando o Sailfin Molly

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando