Este trabalho foi financiado pelo HD068322 K12 (SCM); R01-CA179921 e OD011092 P51 (AVM); e o prêmio 14PRE20320014 de associação de coração da América (SB).

Nota: todos os procedimentos descritos no presente protocolo devem ser realizados sob condições de BSL-2.
 1. preparação de estoque KSHV <ol><li>buffer de TNE preparar: dissolver 292,24 mg EDTA em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Dissolver 605,7 mg Tris em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Combine as soluções de EDTA e Tris, adicionar 4,38 g NaCl, ajustar volume final de 500 mL, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° C .</li>
	<li>Cultura o KSHV-positivo, EBV-negativo efusão primária linfoma célula linha BCBL-1 numa incubadora umidificado em 37 ° C, mais 5% de CO 2 em RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e antimicrobianos para aproximadamente 1 a 1.2 x 10 6 células / mL.</li>
	<li>Para induzir a produção de KSHV, dividir culturas 1:2 com meio fresco e adicione Phorbol Myristate 12 13-acetato (PMA) a uma concentração final de 20 ng/mL e incubar as culturas por 5 dias. Como alternativa, tratar as células com butirato de sódio (NaB; 0,1 mM) por 3 dias para induzir a replicação viral lítica.</li>
	<li>Para coletar partículas virais, primeiro centrifugar a cultura sobrenadante a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente para as células de pelotas e transferir sobrenadantes para tubos frescos.</li>
	<li>Para esclarecer o sobrenadante por forma a evitar a transferência dos restos celulares, centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. 
	Observação: como alternativa para centrifugação de alta velocidade para esclarecimentos de sobrenadantes de cultura, filtração através de uma estéril 0,45 µm filtro pode ser executado. Temos observado uma queda significativa no título usando filtragem; Portanto, rotineiramente realizamos a segunda etapa de centrifugação em vez disso.</li>
	<li>Em seguida, sobreposição de 5 mL de solução de sacarose 25% em tampão TNE com cerca de 30 mL da cultura esclareceu sobrenadante em 6 tubos de se.</li>
	<li>Centrífuga equilibrado tubos a 75.000 x g, durante 2 h a 4 ° C, sob vácuo.</li>
	<li>Decante o sobrenadante de cultura e borre a borda de cada tubo para remover tanto solução sobrenadante e sacarose quanto possível e, em seguida, Ressuspender o vírus, que pode não ser visível, em 150 µ l de tampão TNE.</li>
	<li>Vírus da piscina todas resuspended, misture bem e congelar 25 alíquotas µ l a -80 ° C .</li>
</ol> 2. Transdução da CE com E6 e E7 Papillomavirus Genes Nota: rotineiramente utilizamos frascos de cultura de tecido padrão para o cultivo primário EC. No entanto, se crescimento insatisfatório da CE é obtido então o uso de frascos de cultura comercial deve ser considerado.
<ol><li>Cultura primária humana dérmica microvascular ou linfática CE numa incubadora umidificado em 37 ° C, acrescido de 5% de CO 2 em meio de crescimento do CE (EGM; contém CE basal suplementado [EBM] com EGM-2 BulletKit [FBS, que contém Hidrocortisona, fator de crescimento do fibroblasto humano-B, fator de crescimento vascular CE, fator de crescimento semelhante à insulina 1, ácido ascórbico, fator de crescimento epitelial humana, antibióticos e heparina]) num frasco de cultura celular T75 para aproximadamente 50% confluência.</li>
	<li>Para transdução, cultura PA317 LXSN 16E6E7 pilhas de 24 , 35 numa incubadora umidificado a 37 ° C mais 5% de CO 2 em DMEM suplementado com 10% FBS e antimicrobianos em um T150 celular cultura balão até que eles são cerca de 90% de Confluencia. Então incubar durante uma noite em 16 mL de meio.</li>
	<li>Esclarecer o meio PA317 por centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar as células de cultura e sobreposição de CE com 12 mL de meio de PA317 esclareceu a EGM e incubar durante 4 h. 
	Nota: Centrifugação 16 mL do meio condicionado a 300 x g, durante 5 min resultados em um sedimento compacto que não é perturbada pela cuidado posterior remoção de 12 mL de sobrenadante clarificado. No entanto, se a transferência de células de 16E6E7 de LXSN de PA317 de culturas primárias de CE é uma preocupação (a linha de celular embalagens rapidamente outgrow CE), em seguida filtração do líquido sobrenadante condicionado através de um filtro de 0,45 µm antes da transferência pode ser realizada.</li>
	<li>Substituir 6 mL do meio de PA317 com EGM fresco e incubar durante uma noite.</li>
	<li>CE refeed com 12ml EGM fresco e incubar um mais h. 48</li>
	<li>Para a subcultura do CE, remover médio e lave com 12 mL de PBS sem cações e adicionar 3 mL de solução de dissociação enzimática comercial (por exemplo, TrypLE) por e incubar a 37 ° C por 3 min.</li>
	<li>Transferência de suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células resultante em EGM fresco e dividir uniformemente em 3 frascos de x T75 com um volume final de 12 mL EGM por balão.</li>
	<li>Para selecionar para CE transfectada com E6 e E7, adicionar G418 para uma concentração final de 200 µ g/mL para duas passagens, após o qual a CE transduzida pode ser chapeada para infecção ou congelada em nitrogênio líquido.</li>
</ol> 3. Infecção da CE Transduced com KSHV <ol><li>no dia antes da infecção, colher CE por digestão enzimática, usando a solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de EGM. Use 5 µ l de células para preparar uma diluição 1/10 em Trypan azul. Contar as células ao vivo usando um hemocytometer e semente 2,5 x 10 5 células vivas em 2 mL de EGM por bem em 6 pratos bem.</li>
	<li>No dia de infecção, remover EGM lavar células com 3 mL de PBS com cálcio e magnésio por bem, e em seguida, adicione 2 mL EBM. 
	Nota: É essencial usar EBM, em vez de EGM durante a infecção, como a heparina na EGM inibirá a vinculação de partículas virais para e posterior infecção do destino EC.</li>
	<li>Para infectar as células com KSHV, adicione o caldo de vírus de 5 a 20 µ l de cada poço e agite o prato para misturar. Para células infectadas por simulação adicionem igual volume de tampão TNE a cada poço.</li>
	<li>Centrifugar as placas a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente e então incubar as placas a 37 ° C por 90 min.</li>
	<li>Se o objetivo do estudo é investigar os primeiros eventos que exigem uma síncrona infecção viral, por exemplo, eventos iniciais na infecção de novo, retire o inóculo viral neste ponto. Enxaguar e refeed as células com 2ml EGM fresco. Caso contrário, adicione 2 mL EGM e incubar as culturas durante a noite.</li>
	<li>Refeed células com 2ml EGM o dia após a infecção e depois todos os outros dias.</li>
	<li>Quando as células são aproximadamente 90% de confluencia, colheita por digestão enzimática, usando solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima e, em seguida, as células de três poços em um T75, observando o número total de passagem e a passagem da piscina pós-infecção.</li>
	<li>Expandir mock e KSHV-infectados CE com divisões de 1:3 pelo menos duas passagens mais, momento em que as células podem ser utilizadas em experiências ou congeladas em nitrogênio líquido. 
	Nota: Tal como acontece com a divisão de CE transfectada com E6 e E7, culturas de manutenção de simulação e KSHV-células infectadas por devem ser divididas antes de chegar a confluência (~ 85 a 90%).</li></ol>
 4. confirmando infecção com KSHV por imunofluorescência Nota: deteção do KSHV associada a latência nuclear antígeno (LANA-1/ORF73) fornece uma medida quantitativa confiável da infecção. Anticorpos anti-LANA estão comercialmente disponíveis.
<ol><li>o dia antes da coloração, poços de placa dois, cada um com simulação ou KSHV-infectados CE sobre uma placa de 24 a 1 x 10 5 células por bem em 1 mL EGM e incubar durante uma noite.</li>
	<li>Células de lavar duas vezes com 500 µ l de PBS e mais cálcio e magniseum. Lave por 30 s, sobre uma plataforma oscilante.</li>
	<li>Em uma coifa externamente-ventillated, consertar as células com 500 µ l de paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 mais soro de cabra 0,02% em PBS mais cátions).</li>
	<li>Bloquear células com 500 µ l de soro de cabra 2% em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Etiqueta de um poço de simulação ou KSHV-infectados CE com 200 µ l de anticorpo primário diluído 01:100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um roqueiro. Incubar os restantes dois poços em 200 µ l de tampão de lavagem apenas.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Rotular todos os quatro poços com 200 µ l de anticorpo secundário diluído 1: 100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um balancim.</li>
	<li>Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>a cada poço aplicar 20 µ l de montagem DAPI contendo médio e uma lamela e avaliar a mancha usando um microscópio fluorescente invertido.</li>
	<li>Determinar a infecção por cento das células infectadas KSHV contando o número de núcleos de LANA-positivo pelo menos 200 células. Infecção com recombinante KSHV-Bac16 também pode ser monitorado através da observação de culturas para a expressão de GFP.</li>
</ol>

Mixomas é um processo de várias etapas que contorna precauções importantes dentro de um organismo de36. Como lesões do KS existem ao longo de um espectro de inflamação crônica a verdadeiras sarcomas, elucidação de determinados processos fisiopatológicos mediada por KSHV requer que ser realizados alguns estudos em modelos de cultura de células que suportam transformação9. Note-se que a perda da inibição de contato e crescimento dependente de ancoragem, fenót...

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor de angioproliferativas multi focal afetando sites dérmicas, da mucosa e viscerais que se desenvolve mais comumente na configuração de imunossupressão avançada1. Quatro formas epidemiológicas têm sido descritas: clássico, uma forma indolente que normalmente afeta idosos do património do Mediterrâneo e do Médio Oriente; iatrogênica, resultantes de tratamento com imunossupressores após um transplante de órgão; epidemia, um câncer AIDS-definindo; e endêmicas, uma forma de HIV independente comum em crianças em regiões endêmicas na África. Com o advento dos regimes de drogas anti-retrovirais combinação eficaz para o tratamento do HIV, a epidemia KS é muito menos comumente diagnosticado nos países em desenvolvimento. No entanto, as formas endêmicas e epidêmicas clinicamente agressivas continuam entre os mais comumente diagnosticado câncer em muitos países africanos2,3,4. Portanto, identificação dos medicamentos eficazes patogênese-alvo para o tratamento de KS é uma prioridade de pesquisa.
Histologicamente, as lesões do KS caracterizam-se por neovascularização extensa mas anormal no qual células fusiformes de origem CE formam redes vasculares descontínuos5. Esses vasos anormais ("vasculares fendas") permitem o extravasamento de eritrócitos, que dão lesões sua cor característica. Além disso, lesões contêm numerosos leucócitos que caracterizam a inflamação crônica (ou seja, linfócitos, macrófagos e plasmócitos). Regressão das lesões do KS após reconstituição imunológica tem sido descrita, sugerindo que o KS tem características de uma lesão proliferativa-hiper e um tumor verdadeiro6,7,8,9.
Herpesvírus de KS (KSHV), o agente causador da KS, foi identificado em 199410. Desde então muitos em vitro cultura celular modelos foram desenvolvidos para permitir estudos de patogênese, incluindo células explantados do material de biópsia do tumor e primária ou telomerase-expressando CE infectado com KSHV em vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nenhum dos modelos atualmente disponíveis totalmente recapitula o microambiente do tumor KS, mas todos contribuíram com valiosos conhecimentos para nosso entendimento sobre o Patobiológico de infecção KSHV. Ao contrário de outro conhecido oncogenicidade herpesvirus humano vírus Epstein - Barr (EBV), KSHV prontamente não transformar células em cultura, seguindo de novo infecção19,20,21, 22. no entanto, esta limitação foi superada pela transducing CE humano primário de um misto de origem linfática ou microvascular com o E6 e E7 genes do vírus do papiloma humano tipo 16 antes da infecção com KSHV23,24 . Expressão de oncogenes estes exógenas aumenta drasticamente o potencial transformador de KSHV em vitro em parte fornecendo mais inibição do retinoblastoma proteína e p5323,24. Este método de transdução CE permitiu vários laboratórios para identificar alterações chaves host de expressão gênica de células que são induzidas pela infecção KSHV e que aparecem para facilitar KS célula sobrevivência e proliferação25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. os protocolos descritos neste documento são simples e altamente reprodutível e resultará na geração de idade - e passagem-combinada CE KSHV infectados e controles infectados por simulação que podem ser cultivadas por mais tempo que as células primárias e serão permitem a investigação de mecanismos oncogênicas empregado pelo KSHV. Embora o protocolo inclui um método para a produção de tipo selvagem KSHV da linha de celular de linfoma primário de efusão BCBL-1, CE E6/E7-imortalizado também são altamente suscetíveis à infecção com BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para a preparação de BAC16 são descritos em outro lugar33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor incomum composto por proliferação de células fusiformes que é iniciado pela infecção das células endoteliais (CE) com KSHV e desenvolve-se mais frequentemente no cenário de imunossupressão. Apesar de décadas de pesquisa, tratamento ideal de KS permanece mal definido e os resultados clínicos são especialmente desfavoráveis em recursos limitados. Lesões do KS são conduzidas pela angiogênese patológica, inflamação crônica e mixomas, e vários em vitro celular cultura modelos foram desenvolvidos para estudar estes processos. KS surge a partir de células infectadas KSHV de origem endotelial, então CE-linhagem células fornecem os mais apropriado em vitro substitutos do precursor do fuso celular. No entanto, porque CE têm uma duração limitada em vitro , e que os mecanismos oncogênicos empregados pelo KSHV são menos eficientes do que aqueles de outros vírus oncogenicidade, tem sido difícil de avaliar os processos de transformação primária ou telomerase-imortalizada EC. Portanto, foi desenvolvido um modelo de romance cultura baseada em CE que suporta prontamente transformação após infecção com KSHV. Gravidez ectópica expressão dos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano tipo 16 permite a cultura prolongada de idade - e passagem-combinada mock e KSHV-infectados CE e apoia o desenvolvimento de um verdadeiramente transformado (i.e., oncogenicidade) fenótipo em culturas de células infectadas . Este modelo tractable e altamente reprodutível de KS tem facilitado a descoberta de várias vias de sinalização essenciais com elevado potencial para a tradução em ambientes clínicos.

A morfologia da CE primário é classicamente descrita como "pedra do godo", e esta morfologia não é alterada pela expressão do papilomavírus E6 e E7 genes (figura 1A). Expressão dos genes E6 e E7 sozinhos não induz um fenótipo transformado; assim, as células são suscetíveis a entrar em contato com a inibição e cessarão dividindo ao atingir a confluência na cultura. As células serão no entanto proliferam e regenerar a confluência tripsinização e replati...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K visualizações.  University of Minnesota Medical School. Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

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Biologia

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Investigando o mecanismo de transporte de zinco em células de mamíferos com o ensaio FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Autor em destaque: Explorando a regulação celular do zinco por meio da funcionalidade ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Caracterização de Transportadores de Zinco em Mamíferos Utilizando um Ensaio de Transporte de Zinco In Vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...