이 작품은 지원 K12 HD068322 (SCM)에 의해; R01 CA179921 및 P51 OD011092 (AVM); 그리고 수상 14PRE20320014 미국 심장 협회 (SB)에서.

참고: BSL-2 조건 하에서이 프로토콜에서 설명 하는 모든 절차를 수행 합니다.
 1. KSHV 재고 준비 <ol><li>준비 TNE 버퍼: ddH 2 O 292.24 mg EDTA를 해산, 225 mL를 가져오고 pH 8에 조정. DdH 2 O 605.7 mg Tris를 녹이, 225 mL을 고 pH 8에 조정. EDTA와 트리 스 솔루션을 결합, 4.38 g NaCl을 추가, 500 mL를 최종 볼륨을 조정, 필터링, 소독 및 4 ° C .에서 저장</li>
	<li>문화 KSHV 긍정, 5% CO 2 RPMI 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 약 1 제 보충에 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 EBV 부정적인 기본 유출 림프 종 셀 선 BCBL-1 mL 당 10 6 셀 x 1.2.</li>
	<li>KSHV 생산을 유도 하기 위해 신선한 매체와 문화 1:2 분할 및 20 ng/mL의 최종 농도에 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA)을 추가 하 고 5 일에 대 한 문화를 품 어. 대신, 나트륨 낙 산 염 (NaB, 0.1 m m) 용균성 바이러스 성 복제를 유도 하기 위해 3 일에 대 한 세포 치료.</li>
	<li>바이러스 성 입자를 수확, 먼저 작은 셀을 신선한 튜브 supernatants 전송 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 표면에 뜨는 문화 원심.</li>
	더 명확히 세포질 파편의 전송을 피하기 상쾌한 <li>4에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 ° c. 
	참고:로 명확한 문화 supernatants의 여과 살 균 0.45 μ m 필터를 수행할 수 있습니다 통해 고속 원심 분리에 대안. 우리는 여과;를 사용 하 여 titer에 상당한 드롭 관찰 따라서, 우리가 일상적으로 수행 두 번째 원심 분리 단계 대신.</li>
	<li>다음, 6 ultracentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 명확히 문화의 약 30 mL와 TNE 버퍼에서 25% 자당 해결책의 5 mL을 오버레이.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 진공에서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 75000 x g에서 균형.</li>
	<li>문화 표면에 뜨는 가만히 따르다, 가능한 만큼 상쾌한 및 자당 솔루션을 제거 하려면 각 튜브의 오 점 그리고 TNE 버퍼의 150 µ L에 표시 되지 않을 수 있습니다 바이러스 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수영장 모든 resuspended 바이러스, 잘, 그리고 동결-80 ° C .에서 25 µ L aliquots</li>
</ol> 2. E 6와 E7 유 두 종 바이러스 유전자 EC의 변환 참고: 우리는 일상적으로 기본 적 성장을 위한 표준 조직 배양 플라스 크를 사용 그러나, EC의 불만족 성장을 가져온 경우 다음 상업 문화 플라스 크를 사용 하 여 고려해 야 합니다.
<ol><li>문화 기본 인간의 피부 microvascular 또는 림프 EC 5% 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 CO 2 EC 성장 매체에서 (EGM; EC 기저 매체 [EBM] EGM-2 BulletKit [FBS, 포함 된 보충을 포함 날린, 인간 섬유 아 세포 성장 인자-B, 혈관 EC 성장 인자, 인슐린 같은 성장 인자-1, 아 스 코르 빈 산, 인간 상피 성장 인자, 항생제, 및 헤 파 린]) 약 50% 합류 하 T75 셀 문화 플라스 크에.</li>
	<li>변환, 문화 PA317 LXSN 16E6E7 세포 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 24 , 35 플러스 5% CO 2 DMEM 10 %FBS에 제 보충에 T150 셀 문화 플라스 크 들은 약 90% 합칠 때까지. 다음 매체의 16 mL에서 밤새 품 어.</li>
	<li>Centrifuging 300 x g 실 온에서 5 분에 의해 PA317 매체를 명확히.</li>
	<li>명확히 PA317 매체의 12 mL와 EC 문화와 오버레이 셀에서는 EGM를 제거 하 고 4 헤에 대 한 품 어 
	참고: Centrifuging 16 mL 5 분 결과 명확히 상쾌한의 12 mL의 주의 후속 제거에 의해 방해 하지 소형 펠 릿에 대 한 300 x g에서 조절된 하는 매체의. 그러나, 필요한 경우 기본 EC 문화 PA317 LXSN 16E6E7 셀의 전송 (포장 셀 라인은 신속 하 게 자라 다 EC), 다음 전송 되기 전에 0.45 μ m 필터를 통해 바른된 상쾌한의 여과 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>밤새 품 어 고 신선한 EGM PA317 매체의 6 mL.</li>
	<li>Refeed EC 12 mL와 함께 신선한 EGM 추가 48 헤 알을 품고 고</li>
	<li>EC, 하위 문화 매체를 제거 없이 양이온, PBS의 12 mL로 씻어 여 상업 효소 분리 솔루션 (예를 들어, TrypLE)의 3 개 mL를 추가 그리고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심. 결과 셀 펠 릿 신선한 EGM에서 resuspend와 3 x T75 플라스 플라스 크 당 12 mL EGM의 최종 볼륨을 균등 하 게 나눌.</li>
	<li>E6 및 E7 불리고 EC에 대 한 선택, 두 구절, 후 transduced EC 수 있습니다 감염에 대 한 도금 또는 액체 질소에서 냉동에 대 한 200 µ g/mL의 최종 농도에 G418 추가.</li>
</ol> 3. KSHV로 불리고 EC의 감염 <ol><li>감염 전날에 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 EC 수확. EGM의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 셀의 5 µ L를 사용 하 여 준비 Trypan 블루에서 1/10 희석. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀 및 씨앗 10 5 라이브 셀 6 잘 플레이트에 잘 당 EGM의 2 mL x 2.5.</li>
	<li>감염의 날, EGM 제거 잘, 당 3 mL PBS의 칼슘과 마그네슘을 가진 세포를 씻어 고 다음 추가 2 mL EBM. 
	참고: 그것은 필수적 이다 감염, 동안 EGM 보다 EBM을 사용 하도록 EGM에서 헤 파 린을 바이러스 성 입자의 바인딩 및 대상 적의 후속 감염 억제</li>
	<li>KSHV, 세포를 감염 시킬 각 음을 5 ~ 20 µ L 바이러스 주식을 추가 하 고 소용돌이를 섞어 접시. 모의 감염 된 세포 각 잘 하는 같은 TNE 버퍼 양의 추가.</li>
	<li>실 온에서 30 분 400 x g에서 격판덮개 원심 고 90 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어</li>
	<li>연구의 목표는 조사 초기 이벤트 동기 바이러스 감염, 예를 들면에 드 노 보 감염 초기 이벤트를 요구 하는 경우이 시점에서 바이러스 inoculum을 제거 합니다. 린스 및 2 mL와 함께 셀 refeed 신선한 EGM. 그렇지 않으면, 2 mL EGM 추가 하 고 밤새 문화를 품 어.</li>
	<li>감염 후 다음 매일 2 mL EGM 셀 하루 refeed.</li>
	<li>셀은 약 90% 합칠 때 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 수확 후 총 통과 번호와 통로 지적 T75에 3 개의 우물에서 셀 풀 감염 된 후.</li>
	<li>모의 및 KSHV-감염 된 EC 어느 시간에 세포 실험에 사용 하거나 수 액체 질소에서 냉동 두 개 이상의 더 많은 구절에 대 한 1:3 분할으로 확장. 
	참고: e 6와 E7 불리고 EC의 분할와 마찬가지로 모의 KSHV 감염 세포의 유지 보수 문화 분할 해야 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에.</li></ol>
 4. 면역 형광에 의해 KSHV 감염 확인 참고: KSHV 대기 시간 관련 핵 항 (라-1/ORF73)의 감염의 신뢰할 수 있는 양적 측정을 제공 합니다. 안티-라 나 항 체는 상용.
<ol><li>얼룩, 전날 플레이트 두 웰 스와 모의 또는 KSHV-감염 된 EC 1 x 10 5에서 24-잘 접시에 각각 당 세포 1 mL EGM에서에서 잘 하 고 밤새 품 어.</li>
	<li>세척 셀 두 번 500 µ L PBS 플러스 칼슘과 magniseum의. 30에 대 한 세척 락 플랫폼에 s.</li>
	<li>외부 ventillated 연기 후드, 실 온에서 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 세포 수정.</li>
	<li>셀 워시 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100 플러스 PBS 플러스 양이온에 0.02% 염소 혈 청)의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 2% 염소 혈 청의 500 µ L로 세포를 차단.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>라벨의 모의 또는 KSHV-감염 된 200 µ L의 1 차적인 항 체와 EC 1시 10분 희석 한 잘로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에 0. 워시 버퍼만의 200 µ L에서 나머지 두 개의 우물을 품 어.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 이차 항 체 희석 1: 100의 200 µ L로 모든 4 개의 우물을 라벨.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>각 잘 하려면 중간 포함 DAPI를 탑재 하는 coverslip 20 µ L을 적용 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩을 평가.</li>
	<li>적어도 200 셀에서 라 나 긍정적인 핵의 수를 계산 하 여 KSHV에 감염 된 세포의 백분율 감염을 확인 합니다. 재조합 KSHV Bac16 또한 GFP의 표현 위한 문화의 관찰을 통해 감시 될 수 있다 감염.</li>
</ol>

없음입니다.

발암 circumvents36는 유기 체 내에서 중요 한 보호 하는 다단계 프로세스입니다. KS 병 변 진정한 sarcomas에 만성 염증의 스펙트럼을 따라 존재, KSHV에 의해 중재 특정 pathophysiological 프로세스의 변환9를 지 원하는 셀 문화 모델에 몇 가지 연구를 실시 해야 합니다. 그것은 접촉 금지 및 앵커리지 종속 성장, 고기 세포 변화의 지표로 쉽게 개발 하지 않습니다 주목 해야?...

Kaposi 육 종 (KS)은 고급 면역 억제1의 설정에서 가장 일반적으로 발전 하는 다중 초점 angioproliferative 종양, 점 막, 피부 및 내장 사이트에 영향을 미치는. 4 개의 역학 양식 설명: 클래식, 일반적으로 지중해와 중동 유산;의 노인 들에 영향을 미치는 나태 한 형태 의원 성, 장기 이식; 다음 면역 억제 약물과 치료 결과 전염병, 에이즈-정의 암; 그리고 발병, 아프리카에서 풍토 성 지역에서 아이 들에 있는 일반적인 HIV 독립적인 형태. 에이즈의 치료에 대 한 효과적인 조합 방지 retroviral 약물 regimens의 도래와 함께 전염병 KS 훨씬 덜 일반적으로 개발 도상국에서 진단 이다. 그러나, 임상 적극적인 지방 병 및 전염병 양식 많은 아프리카 국가2,,34진단된 암 중 가장 일반적으로 남아 있습니다. 따라서, KS의 치료에 대 한 효과적인 병 인 대상 약물의 식별은 연구 우선권 이다.
조직학, EC 근원의 스핀 들 세포 불연속 혈관 네트워크5를 형성 하는 의하여 광범위 한 하지만 비정상적인 neovascularization KS 병 변 특징 이다. 이러한 비정상적인 혈관 ("혈관 슬릿") 그들의 독특한 색깔 장애를 주는 적혈구의 넘쳐 흐름을 수 있습니다. 또한, 병 변 수많은 백혈구 (림프 톨, 대 식 세포, 및 플라스마 세포) 만성 염증의 특성을 포함 합니다. KS 병 변 면역 재구성 다음의 회귀, KS 하이퍼 증식 병 변 및 진정한 종양6,,78,9의 기능을가지고 제안 설명 하고있다.
KS herpesvirus (KSHV), KS의 원인이 되는 대리인 199410에서 확인 되었다. 그때 많은 체 외에서 세포 배양 모델 개발 되었습니다 이후 병 인 연구를 활성화 하려면 셀을 포함 하 여 explanted 종양 생 검 재료와 기본에서 또는 telomerase를 표현 EC 감염 KSHV 생체 외에서11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. 현재 사용 가능한 모델의 아무도 완벽 하 게 KS 종양 microenvironment이 하지만 모든 KSHV 감염의 pathobiology의 우리의 이해에 귀중 한 지식을 공헌 했다. 다른 알려진된 tumorigenic 인간 herpesvirus 엡 스타인-바 바이러스 (EBV), 달리 KSHV 않습니다 하지 쉽게 변형 문화 드 노 보 감염19,20,21, 다음에 셀 그러나 22., microvascular 또는 림프는 E6 혼합의 기본 인간의 EC를 시험 하 여이 한계를 극복 하 고 인간 유 두 종에서 E7 유전자 입력 KSHV23,24 감염 전에 16 . 이러한 외 인 oncogenes의 표현은 극적으로 retinoblastoma 단백질 및 p5323,24의 저해를 추가 제공 하 여 일부에 KSHV에서 생체 외에서 의 변형 잠재력을 증가 한다. 이 EC 변환 방법은 키 변경 호스트를 식별 하기 위해 여러 실험실 세포 유전자 발현에 KSHV 감염에 의해 유도 된다 고 KS 세포 생존과 확산25,26 촉진을 나타나는 수 있다 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 여기에 설명 된 프로토콜 간단 하 고 매우 재현, 그리고 나이 고 통과 일치 KSHV 감염 EC 및 모의 감염 컨트롤까지 1 차 셀 이상 경작 될 수 것입니다 생성 귀 착될 것 이다 종양 메커니즘 KSHV에 의해 고용의 수사에 대 한 허용. 프로토콜 기본 유출 림프 종 세포 선 BCBL-1, E6/E7 불후 EC에서에서 KSHV에 매우 취약도 야생 타입의 생산을 위한 메서드가 포함 되어 있지만 감염 재조합 BACmid KSHV BAC1630파생. BAC16의 준비에 대 한 프로토콜은 설명 되어33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposi 육 종 (KS) KSHV, 내 피 세포 (EC)의 감염에 의해 시작 되 고 면역 억제의 설정에서 가장 자주 개발 확산 스핀 들 세포의 구성 된 특이 한 종양 이다. 연구의 십 년간에 불구 하 고 KS의 최적의 치료 남아 가난 하 게 정의 하 고 임상 결과 리소스 제한 설정에 특히 유리한 되지 않습니다. KS 병 변은 병 적인 신생, 만성 염증 및 발암에 의해 구동 됩니다 하 고 다양 한 생체 외에서 세포 문화 모델 이러한 프로세스 연구 개발 되었습니다. 그래서 EC 계보 세포 제공 스핀 들 세포 선구자의 가장 적합 한 생체 외에서 서로게이트 KS 내 피 기원, KSHV에 감염 된 세포에서 발생 합니다. 그러나, EC 수명이 제한 된 생체 외에서 때문에 그리고 KSHV에 의해 고용 되어 종양 메커니즘은 tumorigenic 다른 바이러스의 그들 보다, 그것은 어려운 되었습니다에서 변환의 과정을 평가 하기 위해 또는 telomerase 불후 적 따라서, 소설 EC 기반 문화 모델 쉽게 변환 KSHV 감염 다음을 지 원하는 개발 되었다. 인간 papillomavirus 유형 16의 E6 및 E7 유전자의 소성 식 확장된 문화의 나이 및 통로 일치 모의 및 KSHV-감염 된 EC에 대 한 허용 하 고 진정으로 변환의 개발을 지원 합니다 (즉, tumorigenic) 표현 형에 감염 된 세포 배양 . KS의 세공 및 높은 재현성이 모델 임상 설정으로 번역에 대 한 높은 잠재력을 가진 몇 가지 필수적인 신호 통로의 발견을 촉진 했다.

기본 EC의 형태는 고전적인 "자갈 돌"로 설명 하 고이 형태는 유 두 종 바이러스 E6, E7 유전자 (그림 1A)의 표현에 의해 수정 되지 않습니다. 혼자 E6 및 E7 유전자의 표현; 변형 된 표현 형을 유도 하지 않습니다. 따라서, 셀 문의 억제에 취약 하 고 문화에 합류에 도달 시 분할 하는 것을 중단 됩니다. 그러나 셀 증식 하 고 합류 trypsinization와 낮은 밀도, 모의 감염 컨...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

8.2K 조회수.  University of Minnesota Medical School. Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

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크리스토퍼 휴즈 : Angiogenesis 연구를위한 체외 모델 (인터뷰)

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연구

생물학

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

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In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay(FluoZin-3 분석을 통한 포유류 세포의 아연 수송 메커니즘 조사)

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

저자 스포트라이트: ZnT1 기능을 통한 세포 아연 조절 탐구 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...