Name: analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de PJ da Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (BBSRC; conceder ref BB / K018442 / 1.).

1. Crescimento de plantas de Arabidopsis eo stress tratamento <ol><li> Prepare 1 litro de meio Murashige e Skoog (MS) através da adição de 4,3 g de sal basal MS mistura, 10 g de sacarose, 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) em água desionizada até 1 L, e ajustar o pH para 5,7 com hidróxido de potássio (KOH). Adiciona-se 6 g de phytoagar e autoclave durante 20 min a 120 ° C. <ol><li> Antes de solidificação, despeje o meio em placas de Petri redondos (diâmetro de 9 cm, altura 1,5 cm, com 20-25 mL de meio MS por placa). Permitir que as placas a secar durante ~ 1 h numa câmara de fluxo laminar antes de fechar as tampas. </li></ol></li><li> Coloque as sementes de Arabidopsis thaliana num tubo de ensaio de 1,5 mL para a esterilização da superfície por adição de 1 mL de 70% (v / v) de etanol contendo 0,02% (v / v) de Triton X-100 e agitando continuamente durante 5-10 min. Para cada genótipo / condição, preparar 10 Placas de Petri cada uma com ~ 100 - 150 mudas. </li><li> Aguarde cerca de 10 s até que as sementes para liquidar ofundo do tubo, e, em seguida, desprezar o sobrenadante por pipetagem. Adicionar 1 ml de etanol a 100%, e agitar o tubo novamente por 10 min. </li><li> Preparar a câmara de fluxo laminar, enquanto que as sementes são de esterilização. Pegue um pedaço de papel de filtro por amostra, dobre ao meio para facilitar a semeadura, e mergulhe-o em 100% de etanol na capa. Espere até que seque completamente. Note-se que o etanol a 100% é utilizado como se evapora mais rapidamente do que 70% de etanol. </li><li> Transferir as sementes sobre o papel de filtro usando um pipetando 1 mL ponta da pipeta corte ~ 5 mm da extremidade fina. Deixe secar, o que deve levar cerca de 10 - 15 min. </li><li> Semear ~ 100 - 150 sementes esterilizadas de forma uniforme em cada prato MS meio de Petri, e selar cada placa com fita cirúrgica. </li><li> Armazenar as placas de cabeça para baixo a 4 ° C durante 2 - 4 d para incentivar e sincronizar germinação. sementes velhas pode ter de ficar mais tempo (até uma semana) a 4 ° C. </li><li> Transferir as placas para uma câmara de cultura de tecidos vegetais e deixá-los de cabeça para cima.Deixar crescer as plantas para 8 d sob um ciclo de dia longo (16 horas 100? Mol · m - 2 · s - 1 luz, 8 horas de escuro) a 20 ° C. </li><li> Para o tratamento de estresse, quando as plantas estão 8 d idade, na capela de fluxo, transferi-los a partir do meio agar, por gentilmente raspagem-los à mão usando luvas esterilizadas com etanol, para um frasco esterilizado de meio MS líquido contendo o estressor (por exemplo, , 200 mM de manitol). Evitar a transição de meio de agar. Cobrir a boca balão com uma folha esterilizada e permitir que as plantas a crescer sob as mesmas condições que no passo 1.8 para um adicional de 2 d num agitador orbital, com agitação suave (~ 100 rpm). </li></ol> 2. Fazendo uma proteína precursora por transcrição in vitro / tradução Nota: Este protocolo assume a utilização de Arabidopsis fotossistema I subunidade D precursor (pPsaD) como molde / pré-proteína, mas o método é compatível com os outros. <ol&gt; <li> Clonar a sequência codificadora (CDS) de pPsaD no local de clonagem múltipla (MCS) do vector pBluescript II SK (ou qualquer outro vector similar com um promotor de T7 a montante) 13. Purifica-se o plasmídeo (pBSK-pPsaD) usando um kit de isolamento de ADN e a sequência de verificar por sequenciação de ADN. NOTA: Todos estes passos empregam técnicas padrão de clonagem molecular. </li><li> Determinar a concentração de ADN de plasmídeo pBSK-pPsaD utilizando um espectrofotómetro ajustado para medir a absorvância a 260 nm. Dilui-se o plasmídeo para uma concentração final de 10 ng / mL. </li><li> Executar um 20 ul de PCR (para 35 ciclos) utilizando o plasmídeo diluída como molde. Preparar a reacção da seguinte forma: 2 ul de tampão 10 × polimerase, 2 ul de dNTPs 2 mM, 1 mL de 5 mM de iniciador directo M13 (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 uL de 5 mM de iniciador reverso de M13 (5 &#39;-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3&#39;), 1 uL diluído plasmídeo pBSK-pPsaD, 1 U de Taq polimerase, e água destilada para perfazer o volume total de reacção até20 uL. Utilizar um programa de PCR padrão, como se segue: 95 ° C, 5 min; 35 ciclos de [95 ° C, 30 seg; 56 ° C, 30 seg; 72 ° C, 30 seg); e 72 ° C, 5 min. </li><li> Executar 5 uL do produto de PCR em um 1% (w / v) em gel de agarose em tampão TAE (Tris-HCl, pH 7,6, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) para verificar a amplificação correcta do ADNc, e quantificar a relevante banda em relação aos padrões para confirmar a concentração. Armazenar o resto do produto à temperatura de -20 ° C para outras aplicações. </li><li> Prepara-se uma reacção de 50 uL utilizando um sistema de reticulócitos de coelho lisado com base livre de células de transcrição / tradução compatíveis com o ADN de PCR, como se segue: 40? L de lisado de reticulócitos de o sistema de transcrição / tradução, 2,5 mL radiomarcado [35S] metionina, 11 uCi / ml (actividade específica:&gt; 1000 Ci / mmol), água destilada estéril 2,5 mL, e 5 uL do produto de PCR pPsaD (100-800 ng). Cuidado: Use luvas, roupas de laboratório e glas de segurançases ao manusear material radioativo. Monitorar e descontaminar a superfície de trabalho e equipamentos. Eliminar todos os resíduos radioactivos numa recipiente de resíduos aprovado. </li><li> Incubar a mistura reaccional durante 90 min num banho de água a 30 ° C. Parar a reacção colocando a amostra em gelo. </li><li> Retirar 1 mL de reacção como uma amostra de ensaio (o mesmo volume também podem servir como um controle de entrada para o passo 5.7) para a verificação padrão em electroforese em dodecil sulfato de sódio poliacrilamida gel (SDS-PAGE) seguido por autorradiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo. Um bom resultado é indicado pela observação de uma banda distinta e forte correspondente ao peso molecular de pPsaD (~ 23 kD). Armazenar o resto da reacção a -80 ° C para outras aplicações. </li></ol> 3. Isolamento cloroplastos <ol><li> Prepare as seguintes soluções de: <ol><li> Preparar tampão de isolamento cloroplastos (CIB, 2x): 0,6 M de sorbitol, 10 mM de cloreto de magnésio(MgCl2), Etileno Glicol 10 mM de ácido tetra-acético (EGTA), ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA), bicarbonato de sódio 20 mM (NaHCO 3), 40 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) ; acertar a pH 8,0 com KOH. Preparar 2 L de 2x CIB, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração. Para fazer 1x CIB, diluir a 2x CIB 1: 1 com água destilada; este pode ser preparado de fresco no dia do experimento de isolamento dos cloroplastos. </li><li> Prepare HEPES-tampão MgSO4 -Sorbitol (HMS, 1x): HEPES 50 mM, sulfato de magnésio 3 mM (MgSO 4), 0,3 M de sorbitol; acertar a pH 8,0 com hidróxido de sódio (NaOH). Preparar 400 mL de tampão, fazer alíquotas e mantê-las a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, ou a 4 ° C para armazenagem de curta duração. </li></ol></li><li> Realizar todos os seguintes procedimentos na sala de frio ou em gelo. Precool todas as soluções, dispositivos, equipamentos e rotores antes starting. </li><li> Prepara-se uma gradiente de densidade contínuo através da mistura de 13 mL de Percoll, 13 mL de tampão 2x CIB, e 5 mg de glutationa em um tubo de centrífuga de 50 mL, e centrifugação da mistura a 43000 × g durante 30 min (freio desligado) a 4 ° C. Após centrifugação, o tubo lidar com o cuidado de evitar a perturbação do gradiente e mantê-lo em gelo para uso posterior. </li><li> Transferir 100 mL de 1x CIB por genótipo / condição para uma proveta de 1 L. <ol><li> Retire as mudas a partir do meio líquido por depósito-los em uma peneira, e transferi-los para outro recipiente contendo CIB; em seguida, lavar o tecido com o CIB para remover qualquer meio líquido residual antes de a substituir com 100 mL de CIB fresco. </li></ol></li><li> Para homogeneização, use um total de 100 mL de 1x CIB por amostra em cinco rodadas consecutivas de homogeneização, cada rodada utilizando 20 mL de CIB fresco realizada em um copo de 50 mL. <ol><li> Para a primeira rodada de homogeneização, transferir o tecido da planta para o copo de 50 mL à mão, permitindo que otampão exploração anterior a escorrer por entre os dedos. Tente usar a maior parte do tecido na primeira rodada, mas certifique-se que está imerso com tampão; se isso não for possível, apresente o tecido restante no segundo turno. </li></ol></li><li> Coloque sonda do homogeneizador de tecidos no tecido e homogeneizar com dois impulsos de 1 - 2 s cada. Filtra-se o homogenato através de duas camadas de pano de filtração em um tubo de 250 ml de centrífuga por compressão gentil. Reter o filtrado, e transferir o tecido de volta para a proveta de 50 ml. </li><li> Coloque um segundo 20 mL CIB alíquota para o copo de 50 mL, adicionando qualquer tecido restante não utilizado na primeira rodada de homogeneização, e repita os passos de homogeneização e filtração. Assim, repetir os passos 3.5 e 3.6, até que toda a 100 mL de CIB foi usado para cima (isto é, 5 alíquotas de 20 ml) e combinam-se os filtrados resultantes. </li><li> Centrifugar o homogeneizado reunidas em 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C, e deitar forao sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Ressuspender o sedimento no sobrenadante residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Não ressuspender vigorosamente por pipetagem ou vórtex. </li><li> Suavemente transferir o homogeneizado para o topo do gradiente de densidade contínuo pré-construídos, utilizando uma pipeta de Pasteur para aplicá-lo através da parede do tubo de recepção. Evitar perturbar o gradiente. Centrifugar em um rotor de balde a 7800 × g durante 10 min (freio desligado) a 4 ° C. NOTA: Duas bandas verde pode ser visto no gradiente após centrifugação: a banda inferior contem de cloroplastos intactos, e a banda superior contém cloroplastos quebradas. </li><li> Descartar a banda superior por pipetagem, e, em seguida, transferir a banda inferior com uma pipeta de Pasteur, para um novo tubo de centrífuga de 50 ml, mantendo um volume de até 8 mL por gradiente. </li><li> Adicionar ~ 25 mL de 1x tampão HMS para dentro do tubo e inverter o tubo, duas vezes tO lavar o Percoll a partir dos cloroplastos. Colocar o tubo de novo no rotor de balde e centrifugar a 1000 x g durante 5 min (freio em) a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento em cloroplastos HMS residual deixado no tubo suavemente se agita o tubo em gelo. Adicionar um adicional de 100 - 300 ul de HMS, se necessário (com base no tamanho do grânulo e a contagem no ponto 4), mas não tente para diluir a amostra muito. <ol><li> Mantenha os cloroplastos no gelo. Cada vez antes que os cloroplastos são usados ​​para aplicações a jusante, agite o tubo para ressuspender-los. Sempre use uma ponta de corte pipeta (com um pore ampliado) para transferir os cloroplastos. </li></ol></li></ol> 4. Análise do Rendimento e intacto dos cloroplastos <ol><li> Adicionar 5 uL de cloroplastos isolados de 495 ul de tampão de 1x HMS em um tubo de 1,5 ml, e, em seguida, misturar suavemente por inversão do tubo para obter uma diluição de 1: 100. </li><li> Place uma tampa de vidro na parte superior da câmara de contagem de hemocitómetro. Lentamente pipeta ~ 40 - 60 mL da suspensão diluída de cloroplasto para dentro do intervalo entre o vidro de cobertura e a câmara de contagem. Usando um microscópio de contraste de fase com uma objetiva de 10X ou 20X, cloroplastos intactos olhar em volta e luminosos e estão rodeadas por um halo de luz. NOTA: Sob o microscópio, há uma área de 2 1 mM de contagem com 25 quadrados grandes, cada uma contendo 16 quadrados pequenos no centro da câmara de contagem. </li><li> Contar o número de cloroplastos em 10 grandes praças. O número de cloroplastos por grande praça deverá média entre 10 e 30. Se for muito poucos ou muitos cloroplastos estão presentes, ajustar o fator de diluição (passo 4.1 acima) nesse sentido, e repita o procedimento. </li><li> Calcular o número de cloroplasto por mL (concentração) como se segue: N (o número médio de cloroplastos por quadrado grande calculado no passo 4.3) x 25 (número total de quadrados grandes) × 100 (o factor de diluição) x 10 4 (fator de escala para expressar os dados por 1 ml, uma vez que o volume acima dos 25 quadrados é de 0,1 mm 3). </li><li> Calcular o rendimento real de cloroplastos multiplicando a concentração por o volume de suspensão de cloroplastos obtido no passo 3.12. Normalmente, mais de 50 × 10 6 cloroplastos pode ser obtido. </li></ol> 5. cloroplastos Import Protein <ol><li> Prepare as seguintes soluções de: <ol><li> Preparar tampão 10x HMS: HEPES 500 mM, MgSO 4 30 mM e sorbitol 3,0 M; acertar a pH 8,0 com NaOH. Preparar 50 ml deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo e a 4 ° C para armazenagem de curta duração. </li><li> Prepare Import tampão de paragem: EDTA 50 mM dissolvido em tampão 1x HMS. Prepare 50 mL deste tampão, alíquota, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepare 2x tampão de carga de proteína: Tris-HCl a 60, pH 6,8, 10% (v / v) de glicerol, 2% (w/ V) de SDS, 0,005% (w / v) de azul de bromofenol. Adicione 50 ml e armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 100 mL de 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) a 900 uL de tampão. </li></ol></li><li> Para executar um tempo de curso com 3 pontos de tempo, preparar 3 tubos contendo cada uma alíquota de 130 mL de tampão de paragem de importação, e deixá-los no gelo. Prepare uma reação de importação de 450 mL em um tubo de 2 mL (por genótipo / condição). Descongelar todos os ingredientes, imediatamente antes de usar. <ol><li> Para uma reacção de importação, geralmente usam 10 × 10 6 cloroplastos num volume mL; Por exemplo, se a concentração do cloroplasto é de 2,5 x 10 8 / mL, usar 40 ul de suspensão de cloroplastos. Três pontos de tempo terá 3 × Um mL (ou seja, 120 mL em nosso exemplo). </li><li> Misturar os componentes reacções em gelo na seguinte ordem: água destilada (para perfazer o volume total de 600 mL), tampão B pL de 10x HMS (em que B = [600-3 × A] / 10; isto é, 48 no nosso exemplo), 12 mL1M de ácido glucónico (sal de potássio), 6 mL de 1 M NaHCO 3, 6 mL de 20% (w / v) BSA, 30 ul de adenosina 100 mM de 5&#39;-trifosfato de sal de magnésio (MgATP), 24 uL de metionina 250 mM (não marcado radioactivamente ), e 30 mL precursor da proteína. Imediatamente antes de iniciar a reação de importação, adicionar 3 × Um mL de cloroplastos e misture delicadamente tocando no tubo. </li></ol></li><li> Incubar o tubo de reacção a 25 ° C num banho de água a menos de 100 umol · · m - 2 s - 1 luz. agite ocasionalmente os tubos para voltar a suspender cloroplastos. </li><li> Para realizar um tempo de curso, retirar 130 mL alíquotas a partir da reação no momento de pontos necessários dentro da faixa linear de importação, o que para pPsaD é de até ~ 12 min (4, 8 e 12 mínimo de pontos de tempo são adequados nesse caso). O período de intervalo linear pode variar para diferentes proteínas 14. Assim, sugere-se a pré-proteina testar cada indivíduo antes para optimizar tEle aponta tempo. </li><li> Imediatamente após a retirada, transferir cada alíquota de 130 ul a um tubo de tampão de paragem de importação gelada, misture delicadamente tocando no tubo, e manter todos os tubos em gelo até que o tempo de curso foi concluído. </li><li> Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 12.000 x g numa microcentrífuga, descartar o sobrenadante por pipetagem, e peletes de ressuspender em 15 ul de 2x tampão de carga de proteína por vórtice. </li><li> Analisar todas as amostras mais o controlo de entrada pPsaD (contendo pPsaD equivalente a 10% da quantidade adicionada a cada reacção de importação, a partir do passo 2.7) pelo padrão de SDS-PAGE e auto-radiografia, ou fluorografia de imagem de fósforo 15. Usar a imagem de software de análise de quantificar e analisar os resultados. Para fornecer uma indicação da eficiência da importação, a quantidade de proteína importada em diferentes genótipos / condições pode ser avaliado medindo-se a radioactividade associada a cada banda madura. </li></ol>

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	<li>Jarvis, P., L&#242;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses.">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants.">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li><li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis,+transport,+and+assembly+of+ribulose+1,5-bisphosphate+carboxylase+subunits.">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li><li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase.">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases.">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li><li>Flores-P&#233;rez, &. #. 2. 1. 8. ;., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts.">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import,+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins.">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors.">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor,+atToc33,+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency.">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li><li>Huang, W., Ling, Q., B&#233;dard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane.">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, (1989).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves.">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays.">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li><li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition,+have+unstable+photosystem+I+complexes,+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma.">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li><li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants.">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li><li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts.">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li><li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast.">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li><li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway.">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Recentemente, mostrou que a importação de proteínas de cloroplastos pode ser regulada activamente pelo estresse, que é crítico para a função do cloroplasto e da planta de sobrevivência 3. Nesse estudo, para monitorar essa regulamentação, modificamos nosso isolamento dos cloroplastos e em procedimentos de ensaio in vitro de importação, a fim de permitir avaliar a capacidade de importação de plantas cultivadas sob condições de estresse. Os resultados indicaram um papel importante para o SP1 na regulação de importação de proteína do cloroplasto. Ensaios in vitro de importação convencionais usam plantas cultivadas em MS padrão de meio de agar 6,17,18. No caso de o mutante SP1 descrito aqui, tais ensaios convencionais não revelou quaisquer diferenças de proteínas em relação a importação para o WT 3. No entanto, o papel do SP1 na regulação da importação da proteína é claramente revelado quando a importação de proteínas é avaliado sob condições de stress, utilizando os métodos aqui descritos (Figura 1). Embora may não ser possível comparar directamente os dados de importação a partir do ensaio condições de estresse com os obtidos a partir de ensaios convencionais (como os métodos empregam plantas cultivadas em cultura líquida e em meio agar, respectivamente), as comparações entre condições de estresse e não estresse são viáveis, desde que as plantas são cultivadas no mesmo meio de cultura líquido, com ou sem factores de stress. Comparado com o tratamento de stress em meio de agar, de cultura líquido é mais conveniente para o tratamento de um grande número de plantas necessários para os ensaios in vitro de importação. Além disso, facilita uma aplicação uniforme do estressor a todas as plantas, o que é particularmente importante para os tratamentos de curto prazo do stress. O método aqui apresentado tem sido aplicado para estudar a tensão osmótica usando o tratamento de manitol, mas poderia ser facilmente adaptado para uma vasta gama de outros tipos de stress; por exemplo, estresse salino de curto prazo e estresse oxidativo, para o qual os estressores correspondentes poderia be aplicado da mesma forma através de meio MS líquido. Para outros tipos de estresses, sugerimos o grau de estresse é primeiro otimizado; excessivamente tratamentos graves podem ter efeitos adversos sobre o rendimento e / ou competência de importação das organelas isoladas. Há vários passos importantes no âmbito do protocolo a que se deve prestar uma atenção especial, como detalhado abaixo. A concentração óptima de ágar para o meio MS pode diferir (0,6-0,9%, w / v) dependendo do fabricante. Assim, recomenda-se empiricamente para optimizar a concentração de ágar antes de iniciar as experiências. O meio não deve ser tão suave que ele adere ao tecido na etapa de colheita (passo 1.9), também não deve ser tão difícil que inibe o desenvolvimento das raízes das plantas. A concentração de sacarose também pode ser ajustada de acordo com as plantas utilizadas. Quando se trabalha com os mutantes particularmente doentes, meio MS suplementado com 2-3% (w / v) de sacarose pode ajudar as plantas a crescer melhor. quando appencontrando-se os tratamentos de estresse, não é bom para transferir plantas muito antigas ao meio líquido (por exemplo,&gt; 14 dias de idade). Isso ocorre porque as raízes mais desenvolvidas de plantas mais velhas são mais facilmente danificados durante a transferência. No que diz respeito ao sistema de transcrição / tradução, existem 2 sistemas principais: os baseados no germe de trigo, e aqueles que se baseiam em reticulócitos de coelho. Esses kits podem utilizar diferentes modelos, tais como os plasmídeos linearizados, plasmídeos unlinearized, ou produtos de PCR. Os kits também são específicos para os promotores T3, T7, SP6 e. Note-se que o kit recomendamos aqui só é adequado para utilização com produtos de PCR e o promotor de T7. No entanto, por razões desconhecidas, alguns pré-proteínas radiomarcadas feitas com este sistema pode não funcionar de forma eficiente no ensaio de importação; Em tais casos, pode-se considerar um sistema de tentar extracto de gérmen de trigo ou de um sistema de lisado de reticulócitos de significado para modelos de plasmídeo. Também se pode melhorar o resultado da transcrição / tradução reação, modificando as condições de reacção de acordo com o manual do fabricante. É importante para iniciar o isolamento dos cloroplastos de manhã cedo (ou no início do ciclo de luz da câmara de crescimento), a fim de evitar a acumulação de amido no interior dos cloroplastos devido à fotossíntese, que pode dificultar o isolamento de organelos intactos. O processo de isolamento cloroplasto tem de ser feito rapidamente, sem atrasos desnecessários, e os cloroplastos isolados devem ser mantidos sempre frio. Esta é a atenuar a observação de que cloroplastos isolados perderá gradualmente a sua viabilidade, o que não é bom. Se estiver usando CIB recém-descongelado ou tampão HMS, certifique-se de misturar o tampão antes de usar para obter uma solução homogénea. As condições óptimas para a homogeneização do material vegetal foram estabelecidas empiricamente, e pode variar se um homogeneizador de tecidos diferente é usado. Se os diferentes genótipos de plantas contêm Similar os níveis de clorofila, clorofila quantificação pode ser utilizado como uma forma alternativa para normalizar as amostras antes de conduzir os ensaios de importação. A clorofila pode ser determinada espectrofotometricamente a seguir a extracção de uma amostra dos cloroplastos isolados em 80% (v / v) de acetona aquosa 19,20. No entanto, se as taxas de plantas de importação que mostra diferentes teores de clorofila (por exemplo, mutantes com fenótipos cloróticas) estão a ser comparadas, utilizar o número de cloroplasto contando para normalizar as amostras de cloroplastos nos ensaios de importação. É particularmente importante para ressuspender os cloroplastos completamente no passo 3.11. ressuspensão insuficiente pode deixar agregados de cloroplastos, o que tornará difícil a contagem números com precisão e, portanto, irá dificultar o carregamento correto em reações de importação. Se a agregação grave é visto sob o microscópio (por exemplo, os agregados com&gt; 10 cloroplasto unidas), continue a agitação da amostra cloroplasto em gelo até o aggregatES são removidos. É mais fácil de ressuspender os cloroplastos em um volume mais pequeno de tampão. É importante estar ciente de que as reacções de importação de proteínas (Seção 5) deve ser conduzida com as devidas precauções por causa de sua natureza radioativa. precauções necessárias incluem: o uso de luvas descartáveis, roupas de laboratório e óculos de segurança, monitorização e descontaminação da superfície de trabalho e equipamentos, e eliminação de todos os resíduos radioactivos em um recipiente de resíduos aprovado. Também deve ter em mente que a pressão osmótica correcta é crítica para a manutenção da intacto do cloroplastos durante as reacções de importação, e esta é mantida principalmente pelo buffer HMS. Porque 10x HMS é viscoso, ele deve primeiro ser aquecido à temperatura ambiente, e depois bem misturados e aplicados usando uma ponteira de corte para assegurar a medição de volumes precisos. Na reacção de importação, metionina fria é adicionado para inibir a incorporação de metionina radiomarcado livre em chloropl alheiosAST proteínas através da tradução organelar durante o passo de incubação, enquanto BSA é utilizado para minimizar a proteólise, actuando como um substrato para as proteases.

Os cloroplastos são organitos altamente abundantes que existem nos tecidos verdes das plantas. Eles são bem conhecidos por seu papel crítico na fotossíntese, um processo que utiliza a energia da luz para converter dióxido de carbono em açúcar e, assim, apoiar quase toda a vida na terra 1. Além disso, os cloroplastos (e a família mais ampla de organelos relacionado chamado plastídios) desempenham muitas outras funções vitais nas plantas, incluindo a biossíntese de aminoácidos, lípidos, pigmentos, e a detecção de sinais ambientais, tais como a gravidade e desafio patógeno. Fotossíntese gera espécies reativas de oxigênio (ROS) como subprodutos, que em determinadas circunstâncias têm funções úteis, mas se overproduced pode causar efeitos nocivos ou mesmo letais. A superprodução de ROS é particularmente promovida por condições ambientais adversas, e, portanto, os cloroplastos estão intimamente ligados à respostas a estresses abióticos, como salinidade e estresses osmóticos 2. CHloroplasts têm uma estrutura complexa. Cada cloroplasto é rodeado por uma camada exterior de dupla membrana chamado de envelope, que consiste em membranas externas e internas. Internamente, há um outro sistema de membranas tilacóides chamado, onde as reacções de luz da fotossíntese ocorrem. Entre os dois sistemas de membrana existe uma chamada compartimento aquoso do estroma, que está envolvido na fixação de carbono. A cloroplasto podem conter até ~ 3.000 proteínas diferentes, e que a grande maioria destas proteínas são sintetizadas no citoplasma na forma precursora e precisam ser importados para a organela através translocons proteína dedicados nas membranas de envelope 1. Curiosamente, o trabalho recente indicou que a importação de proteína do cloroplasto é regulada activamente, e por isso é capaz de exercer um importante nível de controle sobre o proteoma do cloroplasto. Por exemplo, foi relatado em 2015 que a importação de proteínas pode responder a estresse abiótico através da regulação direta da abundância de the translocon na membrana do invólucro mais externa dos cloroplastos (TOC) por o sistema ubiquitina-proteassoma 3. Usando cloroplastos purificados e em proteínas precursoras in vitro sintetizado, a importação de proteínas pode ser reconstituída in vitro 4,5. Assim, métodos in vitro pode ser utilizado para avaliar as taxas de importação em diferentes plantas mutantes 6, que tem sido uma abordagem importante para a análise de componentes putativos da maquinaria de importação de proteínas e para descobrir os mecanismos subjacentes a importação de proteínas e sua regulação. Além disso, os cloroplastos podem ser transformados com fraccionamento adicional ou digestão com protease, a seguir importação in vitro, o que pode facilitar estudos sobre a localização sub-organelar e topologia de proteínas de cloroplastos 7,8. Para estudar a regulação da importação de proteínas por estresse, modificamos o nosso método de isolamento de cloroplastos de rotina como iremos descreverAqui. Importante, cloroplastos foram isolados a partir de plantas que tinham sido cultivadas em meio Murashige e Skoog padrão (MS) médio de agar durante 8 dias e depois transferidas para meio MS suplementado com líquido estressor, proporcionando, um stress tratamento relativamente curto controlada. O rendimento e competência dos cloroplastos isolados de tais plantas tratadas com o stress são compatíveis com a jusante no ensaio de importação de proteínas in vitro 3. Para além do protocolo de isolamento do cloroplasto, apresentamos o nosso método de rotina in vitro para a importação de proteínas, o que provou ser robusto e é amplamente utilizado 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basal salt&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>surgical tape (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtration cloth (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifuge bottle</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 250&amp;nbsp;mL bottles (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 50&amp;nbsp;mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radiolabeled [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>phase-contrast microscope (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm depth, 1/400 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>cover glasses</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &amp;times; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microfuge tubes</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid (potassium salt)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>methionine</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>unavailable</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

Cloroplastos são organelas com muitos papéis vitais em plantas, que incluem não só as funções de sinalização fotossíntese, mas numerosos outros metabólica e. Além disso, os cloroplastos são fundamentais para respostas de plantas para vários estresses abióticos, como salinidade e estresses osmóticos. Um cloroplasto podem conter até ~ 3000 proteínas diferentes, alguns dos quais são codificados pelo seu próprio genoma. No entanto, a maioria das proteínas de cloroplastos são codificadas no núcleo e sintetizados no citosol, e estas proteínas têm de ser importados para o cloroplasto através translocons nas membranas do invólucro do cloroplasto. Estudos recentes têm mostrado que a proteína de importação dos cloroplastos pode ser regulado activamente pelo stress. Para investigar bioquimicamente tal regulação de importação de proteínas sob condições de stress, foi desenvolvido o método descrito aqui como um procedimento rápido e simples que pode ser facilmente conseguida em qualquer laboratório. Neste método, as plantas são cultivadas sob condici normaisns e, em seguida, expostos a condições de stress em cultura líquida. O material vegetal é coletado, e cloroplastos são, então, lançado pela homogeneização. O homogenato em bruto é separado por centrifugação de gradiente de densidade, permitindo o isolamento dos cloroplastos intactos. rendimento cloroplasto é avaliada por contagem, e intacto cloroplasto é verificada ao microscópio. Para os ensaios de importação de proteínas, os cloroplastos purificadas são incubadas com 35 S radiomarcado em proteínas precursoras traduzido in vitro, e os experimentos de tempo do curso são realizados para permitir comparações de taxas de importação entre os genótipos sob condições de estresse. Apresenta-se os dados gerados utilizando este método, que mostram que a taxa de importação de proteínas em cloroplastos de um mutante reguladora é alterada especificamente sob condições de stress osmótico.

Um exemplo experimento proteína do cloroplasto importação com 3 pontos de tempo é mostrado na Figura 1. PSAD é um componente de ~ 18 kD do fotossistema I exposta ao estroma, com uma forma precursora de 23 kD, ~ 16. AASI foi selecionado aqui para o ensaio de importação de proteínas in vitro, porque seus níveis de estado estacionário são elevados no mutante SP1, em relação ao WT, sob condições de estresse, sugerindo uma mudança na sua eficiência de importação no mutante 3. O mutante SP1 carrega um defeito em um importante regulador do cloroplasto máquinas de importação de proteína - a proteína SP1 3. Para cloroplastos isolados a partir de plantas crescidas sob condições normais, não havia nenhuma diferença óbvia na importação pSAD entre SP1 e WT (dados não mostrados) 3. No entanto, utilizando os métodos descritos aqui para avaliar pSAD importação para cloroplastos isolados de osmoticamenteplantas estressadas, foi detectada uma diferença clara. Enquanto nós observada a acumulação da forma da proteína madura de uma forma dependente do tempo com ambos os genótipos, a taxa de importação foi significativamente mais baixa para os cloroplastos WT do que para os cloroplastos sp1 (Figura 1), o que é consistente com os nossos resultados anteriores 3, e revela um papel importante para a proteína SP1 na regulação da importação para o cloroplasto de pSAD sob condições de stress. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Figura 1. Uma proteína Import Ensaio realizado utilizando cloroplastos isolados de plantas cultivadas em condições de estresse osmótico. Cloroplastos foram isolados a partir de uma WT 10 dias de idade (Col-0) e um SP1 mutantes plantas de Arabidopsis cultivadas sob condições de estresse (manitol 200 mM) durante 2 d. Importação (A) A proteína foi conduzida utilizando [35 S] -metpPsaD e deixada prosseguir durante 4, 8 e 12 minutos antes da análise por SDS-PAGE e de imagem de fósforo marcado com hionine. Foi analisada em paralelo, o pPsaD controle de entrada 10% compreendendo a proteína traduzida in vitro (IVT). O precursor (pré) e maduro (MAT) formas de pPsaD estão indicadas, enquanto entre existem duas bandas que provavelmente correspondem a produtos de tradução truncadas ou proteolisada porque a sua intensidade não se alterou durante o curso de tempo (*). (B) Para comparar as taxas de importação para os cloroplastos de plantas WT e SP1 cultivadas sob condições de estresse, a intensidade de cada banda correspondente à proteína madura importado em A foi quantificada. Todos os dados são expressos como percentagens da quantidade de proteína importada nos cloroplastos de plantas WT após 12 min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Análise da Importação de Proteínas em Cloroplastos Isolados de Plantas Estressadas | Biologia | Vídeo

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Aqui nós descrevemos um novo método para estudar importação proteína em cloroplastos isolados sob estresse. O método é simples e rápida, e pode ser aplicado para estudar as consequências das diferentes condições de estresse para a importação de proteína do cloroplasto, e os mecanismos de regulação correspondentes.

Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

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21.0K visualizações.  University of Oxford.  Aqui nós descrevemos um novo método para estudar importação proteína em cloroplastos isolados sob estresse. O método é simples e rápida, e pode ser aplicado para estudar as consequências das diferentes condições de estresse para a importação de proteína do cloroplasto, e os mecanismos de regulação correspondentes. 

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Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Bioquímica

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Biologia

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analisando a regulação translacional em Arabidopsis estressada pelo calor

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational activities of various genes can help us understand the molecular mechanisms underlying plant resilience, contributing to the development of crops with enhanced stress tolerance in the face of global climate change. This paper presents a detailed methodology for assessing translation efficiency through polysome profiling in plants exposed to heat stress. The procedure is divided into three parts: heat stress treatment for Arabidopsis, translation efficiency test using polysome profiles, and calculation of translation efficiency by isolating non-polysomal and polysomal RNA based on the profile. In the first part, Arabidopsis plants are subjected to controlled heat stress conditions to mimic environmental challenges. The treatment involves exposing the plants to high temperatures for specified durations, ensuring consistent and reproducible stress induction. This step is crucial for studying the plant's physiological and molecular responses to heat stress. The second part involves the translation efficiency test using polysome profiling. Polysomes are extracted through sucrose gradient centrifugation, which separates mRNAs based on ribosomal loading. This allows for the examination of ribosome occupancy on mRNAs, providing insights into the translational control mechanisms under stress conditions. In the third part, RNA is isolated from both polysomal and non-polysomal fractions. Spike-in RNA is used to accurately measure the amount of RNA in each fraction. The calculation of translation efficiency is performed by comparing the distribution of mRNAs across these fractions under normal and heat stress conditions. The translation activities of specific genes are further assessed by performing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with ribosome-associated RNA and total RNA. This methodology focuses exclusively on the effects of heat stress, providing a detailed protocol for analyzing translational regulation in plants.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Protocolo de perfil de polissomos para estudar a regulação translacional em Arabidopsis sob estresse térmico

The protocol presented here involves polysomal profiling to isolate translatome, mRNAs associated with ribosomes, into non-polysomal and polysomal RNAs from Arabidopsis through sucrose density gradient centrifugation. This method demonstrates the translation efficiency of heat-stressed Arabidopsis.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

Protein Transport to the Thylakoids

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron transport proteins and is enclosed by a thylakoid membrane rich in the light-harvesting complex. Proteins targeted to the thylakoids are transported as precursors and are sorted by the general TOC/TIC import pathway. Once the precursor reaches the stroma, stromal processing peptidases remove their transit signal and expose thylakoid signal sequences. The processed precursors use distinct mechanisms to reach the thylakoid lumen or membrane.
The first mechanism is the chloroplast signal recognition particle or cpSRP-dependent pathway that transports chlorophyll-binding proteins to the thylakoid membrane using energy from GTP hydrolysis. cpSRP proteins and FtsY receptors bind the processed precursor and stimulate GTP hydrolysis. The energy derived facilitates precursor entry through the Alb3 translocase and their subsequent insertion into the thylakoid membranes. In a second mechanism, small thylakoid membrane proteins form soluble stromal intermediates with short hydrophobic signal-like peptides that allow these proteins to fold and insert into the membrane. Once inserted, the signal-like peptides are cleaved by thylakoid processing peptidases to form the mature transmembrane protein. A third pathway employs Oxa-like integrases for inserting thylakoid membrane protein spontaneously without any energy input or targeting factors.
Some proteins targeted to the lumen employ the chloroplast secretory or cpSec pathway, which transports unfolded proteins across the thylakoid membrane. Processed precursors carrying a twin-arginine or RR motif in the N terminal domain often get folded by the stromal chaperonin Cpn60. Folded peptides are then translocated to the thylakoid lumen by the chloroplast twin-arginine or cpTat pathway. cpTat peptidases possess a basic amino acid in their C-terminal domain that helps distinguish and avoid cpSec precursors and cleaves cpTat precursors only.

Transporte de Proteínas para os Tilacoides

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron ...

Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Resumo

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Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

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Transporte de Proteínas para os Tilacoides