Name: analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק PJ מן ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; להעניק נ&quot;צ BB / K018442 / 1.).

<ol>
	<li>Jarvis, P., L&#242;pez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses.">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li><li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants.">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li><li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis,+transport,+and+assembly+of+ribulose+1,5-bisphosphate+carboxylase+subunits.">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li><li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase.">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts.">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li><li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases.">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li><li>Flores-P&#233;rez, &. #. 2. 1. 8. ;., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts.">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import,+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins.">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li><li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors.">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor,+atToc33,+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency.">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li><li>Huang, W., Ling, Q., B&#233;dard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane.">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, (1989).</li><li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves.">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li><li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays.">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li><li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition,+have+unstable+photosystem+I+complexes,+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma.">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li><li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants.">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li><li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts.">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li><li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast.">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li><li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway.">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

הראינו לאחרונה כי יבוא חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח, שהוא חיוני לתפקוד וצומח הכלורופלסט הישרדות 3. במחקר זה, כדי לפקח תקנה כזו, שינינו בידוד הכלורופלסט שלנו ובשיטות assay יבואו במבחנה על מנת לאפשר הערכה של קיבולת יבוא הצמחים הגדלים בתנאי מתח. התוצאות הצביעו על תפקיד חשוב עבור SP1 בתקנה יבוא חלבון הכלורופלסט. מבחני יבוא קונבנציונליים במבחנה להשתמש בצמחים הגדלים על מצע אגר MS תקן 6,17,18. במקרה של מוטצית SP1 המתואר כאן, מבחנים קונבנציונליים כגון לא לחשוף את כל הבדלים ביחס יבוא חלבון אל WT 3. עם זאת, את התפקיד של SP1 בויסות יבוא חלבון מתגלה בבירור כאשר יבואו חלבון נבחן בתנאי קיצון באמצעות השיטות שתוארו לעיל (איור 1). אמנם זה מאיים לא ניתן יהיה להשוות נתוני יבוא ישירות assay בתנאי עקה עם אלה המתקבלים מבחנים קונבנציונליים (כמו השיטות להעסיק צמחים הגדלים בתרבית נוזל על מצע אגר, בהתאמה), השוואות בין מתח תנאים שאינם לחץ הם ריאליות ובלבד הצמחים גדלים כל במדיום התרבות באותו הנוזל, עם או בלי לחץ. בהשוואה לטיפול הלחץ על המדיום אגר, בתרבות נוזל הוא יותר נוח לטיפול של מספר גדול של צמחים הדרושים מבחני יבוא חוץ גופית. יתר על כן, זה מקל על היישום האחיד של גורם דחק לכל הצמחים, וזה חשוב במיוחד עבור טיפולי לחץ לטווח קצר. השיטה המוצגת כאן יושמה ללמוד את הלחץ האוסמוטי באמצעות טיפול מניטול, אבל אפשר להפוך בקלות למגוון רחב של לחצים אחרים; למשל, מתח מלח לטווח קצר סטרס חמצוני, אשר דחק המקבילה יכול bדואר מיושם באופן דומה באמצעות בינוני MS נוזלי. עבור סוגים אחרים של לחצים, אנו מציעים את מידת הלחץ היא מותאמת ראשונה; מדי טיפולים קשים עלולים להיות השלכות שליליות על התשואה ו / או יכולת יבוא של אברונים המבודדים. ישנם מספר צעדים חשובים בתוך הפרוטוקול שאליו אחד צריך להקדיש תשומת לב מיוחדת, כפי שיפורט להלן. הריכוז אגר האופטימלי עבור מדיום MS יכול להיות שונה (0.6 - 0.9%, w / v) בהתאם ליצרן. לפיכך, מומלץ לבצע אופטימיזציה של ריכוז אגר אמפירית לפני תחילת הניסויים. המדיום לא צריך להיות כל כך רך כי היא נדבקת אל הרקמה ליד מדרגת הקציר (שלב 1.9), לא צריך להיות כל כך קשה כי זה מעכב התפתחות שורש צמח. ריכוז סוכרוז יכול גם להיות מותאם על פי הצמחים בשימוש. כשעובד עם מוטציות חולות במיוחד, בינוני MS בתוספת 2 - 3% (w / v) סוכרוז עשוי לעזור לצמחים לגדול טוב יותר. כאשר האפליקציהשוכב טיפולי לחץ, זה לא טוב להעביר צמחים ישנים מאוד למדיום הנוזלי (למשל&gt; בן 14 ימים). הסיבה לכך היא כי השורשים המפותחים יותר של צמחים ישנים פגומים בקלות רבה יותר במהלך מסירה. באשר למערכת תעתיק / תרגום, יש 2 מערכות עיקריות: אלה המבוססים על נבט חיטה, ואלה המבוססים על reticulocyte ארנב. ערכות אלה עשויים להשתמש בתבניות שונות, כגון פלסמידים לינארית, פלסמידים unlinearized, או מוצרים PCR. הערכות גם ספציפיות עבור T3, T7, ומקדמי SP6. ראוי לציין, כי הערכה אנו ממליצים כאן היא מתאימה רק לשימוש עם מוצרי ה- PCR ואת אמרגן T7. עם זאת, מסיבות לא ידועות, כמה preproteins radiolabeled עשה עם המערכת הזו לא יכול לעבוד ביעילות ב assay יבוא; במקרים כאלה, ניתן לשקול לנסות מערכת תמצית נבט חיטה או מערכת lysate reticulocyte מיועד תבניות פלסמיד. אפשר גם לשפר את התוצאה של מחדש שעתוק / תרגוםפעולה על ידי שינוי תנאי תגובה על פי המדריך של היצרן. חשוב להתחיל בידוד הכלורופלסט מוקדם בבוקר (או בשלב מוקדם של מחזור האור של חדר הצמיחה) על מנת למנוע הצטברות של עמילן בתוך כלורופלסטים עקב פוטוסינתזה, אשר יכול לעכב את הבידוד של אברונים שלמים. הליך בידוד הכלורופלסט חייב להיעשות במהירות ללא עיכובים מיותרים, ואת כלורופלסטים המבודדים תמיד חייבים להישמר בקירור. זאת על מנת לסייע בהגנה מפני התצפית כי מבודדת כלורופלסטים יאבדו הכדאיות שלהם בהדרגה, וזה לא טוב. אם אתה משתמש מ.ח. מופשר חדש או חיץ HMS, הקפד לערבב למאגר היטב לפני השימוש כדי להשיג פתרון הומוגני. התנאים האופטימליים עבור המגון של חומר צמחי הוקמו באופן אמפירי, והוא יכול להשתנות אם homogenizer רקמות שונה משמש. אם גנוטיפים צמחים שונים מכילים similaרמות כלורופיל r, כימות כלורופיל יכול לשמש כדרך חלופית לנרמל את דגימות לפני ביצוע מבחני יבוא. הכלורופיל ניתן לקבוע spectrophotometrically הבאים החילוץ של מדגם של כלורופלסטים מבודדים ב -80% (v / v) אצטון מימית 19,20. עם זאת, אם מחירי יבוא הצמחים מראים תוכן כלורופיל שונה (למשל, מוטציות עם פנוטיפים לצהוב) יש להשוות, להשתמש במספר הכלורופלסט לספור לנרמל את דגימות הכלורופלסט ב מבחני היבוא. זה חשוב במיוחד כדי resuspend את כלורופלסטים ביסודיות בשלב 3.11. resuspension מספיק עלול לעזוב אגרגטים של כלורופלסטים, אשר יקשו לספור מספרים במדויק ובכך יפריע את הטעינה הנכונה בתגובות יבוא. אם צבירה חמורה נתפסת מתחת למיקרוסקופ (למשל, אגרגטים עם&gt; 10 הכלורופלסט חברו יחדיו), ממשיך לרעוד המדגם הכלורופלסט על קרח עד aggregates יוסר. קל יותר resuspend את כלורופלסטים בנפח קטן של חיץ. חשוב להיות מודע לכך תגובות יבואו חלבון (סעיף 5) חייבות להתנהל עם אמצעי זהירות מתאים בגלל האופי רדיואקטיבי שלהם. אמצעי זהירות הנדרש כוללת: לובש כפפות חד פעמיות, בגדי מעבדת משקפי מגן, ניטור decontaminating משטח העבודה וציוד, והשלכה של כל פסולת רדיואקטיבית במכל פסולת מאושרת. כמו כן יש לזכור כי הלחץ האוסמוטי הנכון הוא קריטי לשמירה על תקינות של כלורופלסטים במהלך התגובות יבוא, וזה נשמר בעיקר על ידי חיץ HMS. בגלל 10x HMS הוא צמיג, זה צריך להיות מחומם ראשון RT, ולאחר מכן מעורב באופן יסודי, וכן להחיל באמצעות קצה פיפטה לחתוך כדי להבטיח מדידה של כמויות מדויקות. ב תגובת היבוא, מתיונין קר מתווסף לעכב את ההתאגדות של מתיונין radiolabeled החופשי לתוך chloropl הקשורחלבונים אס באמצעות תרגום organellar במהלך שלב הדגירה, בעוד משמש BSA כדי למזער proteolysis על ידי מתנהג כמו מצע של פרוטאזות.

כלורופלסטים הם מאוד אברונים בשפע קיימות ברקמות הירוקות של צמחים. הם ידועים עבור תפקיד קריטי שלהם בתהליך הפוטוסינתזה, תהליך העושה שימוש באנרגיית אור כדי להמיר פחמן דו חמצני לסוכר ובכך לתמוך כמעט כל החיים על פני כדור הארץ 1. בנוסף, כלורופלסטים (והמשפחה הרחבה של אברונים הקשורים שנקראים plastids) לשחק הרבה תפקידים חיוניים אחרים בצמחים, כוללים ביוסינתזה של חומצות אמינו, שומנים, פיגמנטים, ואת החישה של אותות סביבתיים כגון כוח משיכה ואתגר הפתוגן. פוטוסינתזה יוצרת (reactive oxygen species ROS) כמו תוצרים, אשר בנסיבות מסוימות יש תפקידים שימושיים, אבל אם overproduced יכולה לגרום השפעות מזיקות או אפילו קטלניות. ייצור יתר של ROS הוא קידם במיוחד על ידי תנאים סביבתיים קשים, וכך כלורופלסטים קשורים קשר הדוק התגובות מדגיש אביוטי, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי 2. Chיש loroplasts מבנה מורכב. הכלורופלסט כל מוקף שכבה כפולה הממברנה חיצונית קראה את המעטפה, אשר מורכבת של ממברנות חיצונית ופנימית. מבחינה פנימית, יש מערכת קרום אחרת שנקראה תילקואיד, שבו תגובות האור של פוטוסינתזה להתרחש. בין שתי מערכות הקרום מתקיימת שיחת תא מימית את stroma, אשר מעורב קיבוע פחמן. הכלורופלסט עשוי להכיל עד ~ 3,000 חלבונים שונים, ואת הרוב המכריע של חלבונים אלה מסנתזים אותן cytosol בצורה מבשר צריך להיות מיובאים לתוך אברון דרך translocons חלבון המוקדש בממברנות המעטפה 1. מעניין לציין, כי העבודה אחרונה הצביעה על כך יבוא הכלורופלסט חלבון מווסת באופן פעיל, ולכן הוא מסוגל להפעיל רמה חשובה של שליטה על proteome הכלורופלסט. לדוגמא, נמסר כי בשנת 2015 יבוא חלבון יכול להגיב ללחץ אביוטי דרך הרגולציה הישירה של השפע של הדואר translocon על קרום המעטפת החיצונית של כלורופלסטים (TOC) על ידי מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום 3. שימוש כלורופלסטים מטוהרים בחלבונים מבשרים המסונתז במבחנה, יבוא חלבון ניתן מחדש במבחנה 4,5. לפיכך, שיטות חוץ גופייה ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעורי יבוא צמחים מוטנטים שונים 6, אשר כבר פועל מתוך תפיסה ביקורתית לניתוח רכיבים המשוערים של מכונות יבוא חלבון על גילוי המנגנונים יבואו חלבון והרגולציה שלה. יתר על כן, יכול להיות מעובד כלורופלסטים עם חלוקה נוספת או העיכול פרוטאז, הבאים במבחנה יבוא, אשר יכול להקל על מחקרים על לוקליזציה המשנה organellar ואת הטופולוגיה של חלבונים הכלורופלסט 7,8. כדי לחקור את הסדרת יבוא החלבון על ידי מתח, יש לנו שונה שיטת הבידוד הכלורופלסט השגרה שלנו כמו נתארכאן. חשוב לציין, כלורופלסטים בודדו מצמחים שהתפתחו על Murashige הסטנדרטי Skoog (MS) אגרו בינוני במשך 8 ימים ולאחר מכן מועברים לתוך במדיום נוזל MS השלים עם לחץ, מתן טיפול מתח קצר יחסית, מבוקר. התשואה וכשירותו של כלורופלסטים מבודדים מצמחים הלחץ שטופלו כאלה עולים בקנה אחד עם הזרם ב assay יבוא חלבון במבחנה 3. בנוסף פרוטוקול הבידוד הכלורופלסט, אנו מציגים שיטת השגרה שלנו ליבוא חלבון במבחנה, אשר הוכיח להיות חזק והיא בשימוש נרחב 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basal salt&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>surgical tape (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtration cloth (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifuge bottle</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron probe (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 250&amp;nbsp;mL bottles (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>fixed-angle rotor for 50&amp;nbsp;mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radiolabeled [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>phase-contrast microscope (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm depth, 1/400 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>cover glasses</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &amp;times; 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microfuge tubes</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>unavailable</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid (potassium salt)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>methionine</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&amp;nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>unavailable</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants

כלורופלסטים הם אברונים עם תפקידים חיוניים רבים בצמחים, הכוללים לא רק פוטוסינתזה אבל מטבוליות אחרות רבות ופונקציות איתות. יתר על כן, כלורופלסטים הם קריטיים עבור התגובות הצמח לעקות א-ביוטיים שונים, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי. הכלורופלסט עשוי להכיל עד חלבונים שונים ~ 3,000, שחלקם מקודדים על ידי הגנום משלה. עם זאת, הרוב המכריע של חלבונים הכלורופלסט מקודדים בגרעין מסונתז cytosol, וחלבונים אלה צריכים להיות מיובאים לתוך הכלורופלסט דרך translocons על ממברנות המעטפה הכלורופלסט. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייבוא ​​חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח. כדי לחקור כגון רגולציה ביוכימית של יבוא חלבון בתנאי קיצון, פיתחנו את השיטה המתוארת כאן כהליך מהיר וברור שניתן להשיג בקלות בכל מעבדה. בשיטה זו, צמחים גדלים תחת אוורור נורמליns ולאחר מכן נחשף למצבי לחץ בתרבות נוזלית. חומר צמחי נאסף, כלורופלסטים הם מכן שוחררו על ידי המגון. את homogenate הגולמי מופרד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, המאפשר בידוד של כלורופלסטים ללא פגע. תשואה הכלורופלסט נבחנת על ידי ספירה, ו תקינות הכלורופלסט נבדקת במיקרוסקופ. עבור מבחני יבוא חלבון, כלורופלסטים מטוהרים מודגרת עם 35 radiolabeled S בחלבונים מבשר מתורגם במבחנה, וניסויים מנות זמן נערכים כדי לאפשר השוואות של שיעורי הייבוא בין גנוטיפים בתנאי קיצון. אנו מציגים נתונים שנוצרו באמצעות שיטה זו אשר מראה כי שיעור יבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מן מוטצית רגולטורית משתנה במיוחד בתנאי קיצון האוסמוטי.

ניסוי יבוא הכלורופלסט חלבון למשל עם 3 נקודות זמן מוצג באיור 1. PsaD הוא ~ 18 KD רכיב של photosystem חשפתי אל stroma, עם טופס מבשר של ~ 23 KD 16. PsaD נבחרה כאן עבור assay יבוא החלבון במבחנה כי הרמות היציבות שלה הן גבוהות של מוטצית SP1, ביחס WT, בתנאי קיצון, דבר המצביעה על שינוי יעילות היבוא שלה המוטציה 3. מוטצית SP1 נושאת פגם וסת חשוב של מכונות יבוא חלבון הכלורופלסט - את SP1 החלבון 3. עבור כלורופלסטים מבודדים מצמחים הגדלים בתנאים רגילים, לא היה הבדל ברור ביבוא PsaD בין SP1 ו- WT (מידע לא מוצג) 3. עם זאת, באמצעות השיטות שתוארו כאן כדי להעריך ייבוא ​​PsaD לתוך כלורופלסטים מבודדים אוסמוטיצמחים הדגישו, הבדל ברור זוהו. בעוד צפינו ההצטברות של טופס החלבון הבוגר באופן תלוי-זמן עם גנוטיפים הם, שיעור יבוא היה נמוך משמעותי עבור כלורופלסטים WT מאשר כלורופלסטים SP1 (איור 1), אשר עולה בקנה אחד עם תוצאות ניסויים עד כה 3, וחושף תפקיד חשוב לחלבון SP1 בוויסות יבוא הכלורופלסט של PsaD בתנאי קיצון. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> איור 1. חלבון Assay היבוא שנעשה בעזרת כלורופלסטים מבודדים מצמחים הגדלים בתנאי קיצון אוסמוטי. כלורופלסטים בודדו מתוך WT 10 יום בן (Col-0) ו צמחי ארבידופסיס מוטצית SP1 גדלו בתנאי מתח (200 המ&quot;מ מניטול) עבור 2 ד. (א) יבוא חלבון נערך באמצעות [35 S] -methionine שכותרתו pPsaD ואפשר להמשיך במשך 4, 8 ו -12 דקות לפני הניתוח על ידי SDS-PAGE ו הדמית זרחן. במקביל, שליטת קלט 10% pPsaD המהווים במבחנה מתורגמת חלבון (IVT) נותח. המבשר (מראש) ובוגרת (מחצלת) צורות pPsaD מסומנות, כאשר בין לבין יש שתי להקות מתאימות סביר מוצרי תרגום קטועים או proteolyzed בגלל האינטנסיביות שלהם לא השתנתה במהלך הזמן (*). (ב) כדי להשוות את שיעורי היבוא לתוך כלורופלסטים מצמחי WT ו SP1 גדלו בתנאי מתח, האינטנסיביות של כל להקה המתאימה חלבון בוגר מיובא הייתה לכמת. כל הנתונים הם מבוטאים באחוזים של כמות החלבון מיובא כלורופלסטים מצמחי WT לאחר 12 דקות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants at JoVE.com

ניתוח ייבוא ​​חלבון לכלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.

ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K Views.  University of Oxford.  כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל. 

Video: Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Biochemistry

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many secondary metabolites and lipids. Chloroplasts require a large number of proteins for these various physiological processes. Over 95% of chloroplast proteins are nucleus-encoded and imported into chloroplasts from the cytosol after translation on cytosolic ribosomes. Thus, the proper import or targeting of these nucleus-encoded chloroplast proteins to chloroplasts is essential for the proper functioning of chloroplasts as well as the plant cell. Nucleus-encoded chloroplast proteins contain signal sequences for specific targeting to chloroplasts. Molecular machinery localized to the chloroplast or cytosol recognize these signals and carry out the import process. To investigate the mechanisms of protein import or targeting to chloroplasts in vivo, we developed a rapid, efficient protoplast-based method to analyze protein import into chloroplasts of Arabidopsis. In this method, we use protoplasts isolated from leaf tissues of Arabidopsis. Here, we provide a detailed protocol for using protoplasts to investigate the mechanism by which proteins are imported into chloroplasts.

Here we describe a protocol to express proteins into protoplasts by using PEG-mediated transformation method. The method provides easy expression of proteins of interest, and efficient investigation of protein localization and the import process for various experimental conditions in vivo.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח רגולציה תרגומית בארבידופסיס בסטרס חום

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational activities of various genes can help us understand the molecular mechanisms underlying plant resilience, contributing to the development of crops with enhanced stress tolerance in the face of global climate change. This paper presents a detailed methodology for assessing translation efficiency through polysome profiling in plants exposed to heat stress. The procedure is divided into three parts: heat stress treatment for Arabidopsis, translation efficiency test using polysome profiles, and calculation of translation efficiency by isolating non-polysomal and polysomal RNA based on the profile. In the first part, Arabidopsis plants are subjected to controlled heat stress conditions to mimic environmental challenges. The treatment involves exposing the plants to high temperatures for specified durations, ensuring consistent and reproducible stress induction. This step is crucial for studying the plant's physiological and molecular responses to heat stress. The second part involves the translation efficiency test using polysome profiling. Polysomes are extracted through sucrose gradient centrifugation, which separates mRNAs based on ribosomal loading. This allows for the examination of ribosome occupancy on mRNAs, providing insights into the translational control mechanisms under stress conditions. In the third part, RNA is isolated from both polysomal and non-polysomal fractions. Spike-in RNA is used to accurately measure the amount of RNA in each fraction. The calculation of translation efficiency is performed by comparing the distribution of mRNAs across these fractions under normal and heat stress conditions. The translation activities of specific genes are further assessed by performing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with ribosome-associated RNA and total RNA. This methodology focuses exclusively on the effects of heat stress, providing a detailed protocol for analyzing translational regulation in plants.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: פרוטוקול פרופיל פוליזום לחקר ויסות תרגומי בארבידופסיס תחת לחץ חום

The protocol presented here involves polysomal profiling to isolate translatome, mRNAs associated with ribosomes, into non-polysomal and polysomal RNAs from Arabidopsis through sucrose density gradient centrifugation. This method demonstrates the translation efficiency of heat-stressed Arabidopsis.

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

Protein Transport to the Thylakoids

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron transport proteins and is enclosed by a thylakoid membrane rich in the light-harvesting complex. Proteins targeted to the thylakoids are transported as precursors and are sorted by the general TOC/TIC import pathway. Once the precursor reaches the stroma, stromal processing peptidases remove their transit signal and expose thylakoid signal sequences. The processed precursors use distinct mechanisms to reach the thylakoid lumen or membrane.
The first mechanism is the chloroplast signal recognition particle or cpSRP-dependent pathway that transports chlorophyll-binding proteins to the thylakoid membrane using energy from GTP hydrolysis. cpSRP proteins and FtsY receptors bind the processed precursor and stimulate GTP hydrolysis. The energy derived facilitates precursor entry through the Alb3 translocase and their subsequent insertion into the thylakoid membranes. In a second mechanism, small thylakoid membrane proteins form soluble stromal intermediates with short hydrophobic signal-like peptides that allow these proteins to fold and insert into the membrane. Once inserted, the signal-like peptides are cleaved by thylakoid processing peptidases to form the mature transmembrane protein. A third pathway employs Oxa-like integrases for inserting thylakoid membrane protein spontaneously without any energy input or targeting factors.
Some proteins targeted to the lumen employ the chloroplast secretory or cpSec pathway, which transports unfolded proteins across the thylakoid membrane. Processed precursors carrying a twin-arginine or RR motif in the N terminal domain often get folded by the stromal chaperonin Cpn60. Folded peptides are then translocated to the thylakoid lumen by the chloroplast twin-arginine or cpTat pathway. cpTat peptidases possess a basic amino acid in their C-terminal domain that helps distinguish and avoid cpSec precursors and cleaves cpTat precursors only.

הובלת חלבונים לתילקואידים

Thylakoids are membrane-bound sac-like structures within the chloroplast that serve as sites for photosynthesis. Thylakoid lumen contains many electron ...

ניתוח של ייבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

הובלת חלבונים לתילקואידים

ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

הובלת חלבונים לתילקואידים

ניתוח של ייבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים