Name: applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair
Uploaded: 2016-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair at JoVE.com

The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

Todos os animais foram tratados com humanidade e todos os protocolos foram aprovados pela Universidade de Virginia IACUC. 1. Preparação Equipamento <ol><li> Certifique-se de que todas as máquinas estão conectados corretamente. </li><li> Ligue o computador, seguido do estimulador bifásica de alta energia e um sistema de alavanca de modo duplo. </li><li> Neste momento, colocar o animal na câmara de anestesia fornecido com isoflurano a 2%, e ligar o elemento de aquecimento de modo a que a plataforma é aquecida a 37 ° C. </li><li> Colocar os eletrodos em 70% de etanol, para que dicas o politetrafluoretileno (PTFE) revestidos estão submersos e serão desinfectados ao configurar o dispositivo e software. </li><li> Localize e abra o software de controle de sistema de alavanca no ambiente de trabalho. NOTA: Este será o software necessário para realizar testes funcionais. </li></ol> Setup 2. Software <ol><li> Uma vez que o programa é aberto (Figura 1A), alterar o parâmetros para Stim instantâneo no menu de configuração para os valores desejados. NOTA: Neste protocolo, todos os parâmetros permanecem em níveis predefinidos, com excepção de &quot;Run Time (s)&quot;, que é alterado para 180 segundos (Figura 1B). </li><li> Criar uma pasta Autosave sob o menu de configuração. </li><li> Localize uma janela de tipo capaz rotulado de &quot;salvamento automático Base&quot;. Insira o nome da amostra, por exemplo &quot;Rat1-date-timepoint&quot;. Diretamente à esquerda da janela do tipo capaz de &quot;salvamento automático Base&quot;, clique na caixa &quot;Ativar salvamento automático.&quot; </li><li> Na parte superior da tela de controle, selecione &quot;Sequencer&quot;. Uma nova janela se abrirá. Na parte inferior da nova janela, selecione &quot;Sequência Open&quot;. Uma nova janela se abrirá. Selecione a sequência de premade e clique em OK. A lista de protocolos com os parâmetros de sequência, incluindo a frequência, duração dos estímulos, e tempo de descanso irá desenvolver na janela com o nome: editor de sequência (Figura 1C). Clique em &quot;Sequence Load&quot; -&gt; &amp; #34; Close Window &quot;. </li><li> Para ver em tempo real atual e estímulo, selecione &quot;File&quot; -&gt; &quot;Data Monitor Live&quot;. Uma nova janela se abrirá. </li><li> Na nova janela Live Data, a tela de formato para o teste usando a função de escala automática, ou inserir manualmente os valores de y máximo e mínimo mostrados na tela. </li></ol> 3. animal Set-up NOTA: Todas as medidas de força são as de um 11 semanas de idade ratos Lewis. Existe uma correlação linear entre a massa muscular e produção de força (em Newtons). Portanto, como a idade do rato aumenta, os valores de força produzida pela perna deve aumentar também. <ol><li> Assegure-se que o animal se encontra no plano de anestesia adequada antes de o retirar da câmara de anestesia. Remover completamente todos os pêlos na face lateral entre o tornozelo e da pelve da perna experimental utilizando uma máquina de cortar cabelo elétrica. NOTA: O plano de anestesia adequada é obtida quando o i animaisé não-responsivos a uma pitada dedo do pé. É necessário seguir as orientações apresentadas por Comitê Animal Care e Use de cada instituição. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal, garantindo o nariz do animal é firmemente no cone anestesia nariz para que ele permaneça na profundidade suficiente de anestesia. </li><li> Regular a posição do pedal do aparelho por três botões independentes (Figura 2). Usando o botões (A e B) para ajustar o pedal, colocar o aparelho de pedal na sua posição mais à esquerda e mais baixa, respectivamente. Isto irá permitir o correto posicionamento do pé do animal, deixando espaço para manipulações posteriores. Nesta posição, utilizar o botão do lado esquerdo da faixa para mover o aparelho para perto ou para mais longe do experimentador modo que a perna animais assenta num plano direito. </li><li> Limpar a perna com três mudanças de iodo e álcool. O iodo deve permanecer na perna durante 30 seg. </li><li> Ajustar o animal ou plataforma(Figura 2A, D) de modo que a perna estendida assegura o contacto completo entre a sola do pé e o pedal de pé. </li><li> Usando fita adesiva médica, proteger o pé do animal contra a placa de pé (Figura 2D). É crucial que o calcanhar é nivelado contra a parte inferior do pedal e todo o pé é plana e não irá desalojar a partir da placa durante o teste. </li><li> Localizar o mecanismo de fixação para estabilizar a perna. Empurre o pino estabilizador no longe o suficiente para reduzir o movimento da perna e fixá-la no lugar, girando a chave Allen. </li><li> Nesta posição, o botão de usar C para mover o aparelho para perto ou para longe do experimentador para que o tornozelo, a tíbia e fémur mentira em linha recta (Figura 2C). Certifique-se de que a perna seja paralelo com o pedal de pé. Fazer ajustes no campo e botões finos encontrados na parte de trás do aparelho, a mover-se lentamente o tornozelo, de modo que o pé e a tíbia estão em uma posição de 90 °. </li><li> continue para mover a perna para que o fémur ea tíbia estão em um 90 graus ângulo perpendicular (Figura 2B). Neste ponto, o animal está pronto para os eléctrodos. </li></ol> 4. colocação dos eletrodos <ol><li> Ative &quot;Stim instantânea&quot;, clicando no botão laranja rotulada &quot;Stim instantânea&quot;. </li><li> Colocar os dois eléctrodos superficialmente sobre a extremidade proximal do tibial anterior e mover as pontas dos eléctrodos em volta até picos são observados no monitor vivo. Idealmente, os picos deve ser em torno de 0,4 N. NOTA: Os eléctrodos deve ser colocado adjacente e ortogonal ao plano do nervo peroneal, que por sua vez, corre lateralmente a partir do joelho e perpendicular à tíbia. </li><li> Inserir uma agulha longe o suficiente para derme Pierce, e apenas na camada muscular. Mova o outro eletrodo ao redor até picos são vistos no monitor ao vivo cerca de 0,6 agulhas N. Insira e prenda-os no lugar usando uma braçadeira hobby ou fita adesiva médica. </li><li> UMAdjust ajustes finos e grossos para encontrar saída de força máxima. </li><li> No estimulador bifásica de alta potência, haverá dois botões no centro. Uma é rotulado de &quot;GAMA&quot; eo outro &quot;AJUSTE&quot;. Gire o botão &quot;RANGE&quot; para a corrente máxima desejada. NOTA: Os picos irá aumentar lentamente em magnitude, e a intensidade da corrente máxima é determinada como o nível no qual três estimulações consecutivas resultar em respostas contrácteis idênticos. Resista transformando a amperagem maior do que o necessário; a amperagem máxima vai estimular todo o músculo se contraia, mas qualquer corrente mais elevada resultará no recrutamento dos músculos vizinhos e antagonistas potencialmente bem. </li><li> Gire o botão &quot;AJUSTE&quot; para definir a percentagem do &quot;RANGE&quot; que será usado para estimular o músculo. Neste ponto, a força deve ler-se em cerca de 1,0 N. Isto pode requerer um aumento ou diminuição na corrente. </li><li> Verifique novamente os eletrodos para se certificar de que eles são seguros. PareStim instante. </li><li> Na janela &quot;Live Data&quot;, clique em &quot;Start Sequence&quot;. </li><li> Continuar a acompanhar as curvas, indo de volta para o ecrã de controlo, e clicando no botão &quot;Análise&quot;, localizado acima da laranja &quot;Stim instantânea&quot; botão. A curva tetânica deve começar a tomar forma em torno da estimulação 60 Hz. </li></ol> 5. Acabamento Estimulação e Clean Up <ol><li> Depois da sequência de terminar, retire os eletrodos e limpe com álcool a 70%. Colocar os eletrodos nas tampas. </li><li> Solte a braçadeira do joelho e desligue a anestesia. Remover o animal a partir do gás anestesia e colocar o animal em decúbito ventral, ainda na almofada de aquecimento. Manter o rato em 100% O 2 durante alguns minutos após o gás isoflurano foi desligado para manter o rato oxigenado. O animal pode mover-se, inicialmente, mas não devolver o animal de volta para a jaula até que o animal recupere a consciência. Se a dor muscular é notadoapós a recuperação, deve ser dada uma dose de AINE conforme especificado pelo seu comitê de cuidados com os animais. </li><li> Desligue todos os equipamentos listados na etapa 1.2, feche o software, e continuar a análise dos dados. </li><li> Limpe a plataforma e pé pedal. </li></ol> Análise 6. Os dados NOTA: A análise dos dados é feita para caber uma sequência projetada por este laboratório e de acordo com protocolos de laboratório. valores de análise, os pontos de importância de dados e outros aspectos do procedimento irá mudar dependendo da intenção do usuário. <ol><li> Abra o software de análise de dados. </li><li> Clique no menu High Throughput para permitir a análise de vários arquivos de dados (amostras) de cada vez. Selecione &quot;Força Frequency&quot; Análise. </li><li> Clique no botão &quot;Escolher arquivos&quot; e abrir tantos arquivos de dados salvos como desejado. </li><li> Selecione &quot;Manual&quot; na caixa de Cursor método de colocação. NOTA: Isto irá permitir que o usuário para analisar toda a datum dentro de um marcador de tempo desejado, em oposição ao programa seleccionar automaticamente a localização análise. </li><li> Altere o valor timestamp End Cursor para 2. Clique no botão &quot;Analisar&quot; (Figura 1D). </li><li> Para salvar a tabela e analisar os dados usando uma planilha, clique no botão &quot;Salvar tabela botão para ACSII. Isto irá salvar o arquivo, e pode ser aberto com uma planilha em um momento posterior. </li><li> Abra o arquivo de dados salvos na planilha. </li><li> Criar uma coluna adicional denominada &quot;máxima absoluta&quot;, e determinar a diferença entre a linha de base e os valores máximos para cada amostra. Isto irá fornecer a força máxima total produzida em cada frequência. </li><li> Para determinar o torque, multiplicar cada valor de força por o comprimento do braço de alavanca. NOTA: neste caso, que pode ser representado pelo comprimento do pé do animal. Este protocolo utiliza o valor médio determinado experimentalmente de 30 mm. O usuário tem determinado agora os valores para o mabinário ximum produzida em cada frequência. </li><li> Represente graficamente estes valores como uma curva de frequência de binário, ou, o binário máximo produzido pelo animal através de todas as frequências de estimulação. NOTA: Este pode ser identificados e utilizados como um único ponto de comparação entre amostras. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo demonstra um método relativamente simples para a realização de testes em função do músculo in vivo no compartimento crural anterior do membro posterior de rato. Outras formas de teste de função muscular, incluindo ex vivo e in situ protocolos, também pode fornecer informações importantes sobre a fisiologia muscular. No entanto, o significado da in vivo testes de função reside na sua natureza não invasiva, eo fato de que ele recapitula de forma mais precisa os mecanismos endógenos de estimulação muscular. Para tanto ex vivo e em ensaios in situ, o tendão e / ou músculo estão expostas, e, por conseguinte, devem ser mantidas húmidas ou submerso 41,42. Ensaios in vivo remove variáveis de confusão de trauma e inflamação que podem ser provocadas por procedimentos cirúrgicos necessários no teste de função muscular situ; isso é especialmente importante se o objetivo do experimento é investigar os processos inflamatórios e celulares <s-se&gt; 43. Além disso, os ensaios in vivo requer pouca habilidade cirúrgica como o músculo não é isolada do seu ambiente e não requer nós precisos para reduzir músculo / tendão de deslizamento (como é o caso de testes in situ ou ex vivo) 41. Além disso, com a prática suficiente, a velocidade da colocação do eletrodo correto e a capacidade de rapidamente fazer ajustes para alcançar a produção de força máxima do músculo irá garantir que a conclusão do protocolo é rápida e reproducible- tanto dentro animais e entre diferentes usuários do mesmo equipamento 39 . É benéfico para começar com uma avaliação de todo o componente crural anterior tal como ilustrado, antes da excisão dos músculos sinérgicos menos acessíveis (EDL e HL) para investigação mais directa do músculo TA. Usando essa abordagem, pode-se muito rapidamente conseguir o domínio da técnica. Enquanto o processo aqui descrito demonstra e destaca a utilidade de uma força Frprotocolo equency para induzir tétano e determinar a força máxima produzida por um músculo, os usuários devem determinar o tipo (s) de teste funcional que melhor informar a sua experiência específica (s) e objetivos de pesquisa. Existem vários passos críticos que devem ser cuidadosamente realizada, a fim de garantir resultados experimentais óptimas e reprodutíveis, isto é, a produção da força máxima consistente pelo músculo para uma variedade de parâmetros de estimulação. Várias das principais características estão descritas na Figura 2. No entanto, a colocação ea estabilidade do eletrodo estimulando adequada é um pré-requisito absoluto para estimulação máxima reprodutível do nervo peroneal. A este respeito, os eléctrodos devem ser colocados superficialmente. Isto é, se a colocação do eléctrodo é muito profundo, uma arrisca estimulação eléctrica directa dos músculos antagonistas, diminuindo, assim, a magnitude da resposta contráctil observada do compartimento crural anterior. Além disso, odois eléctrodos deve ser colocado na proximidade de uns com os outros quanto possível para reduzir a resistência eléctrica da pele e do tecido conjuntivo circundante. Em geral, posicionamento dos eletrodos perto do joelho e medial da perna rastreamento diretamente à beira do tibial anterior para onde ele se encontra com o gastrocnêmio, muitas vezes produz a produção de força adequada. Isto também assegura que os eléctrodos estão colocados adjacentes e ortogonais ao plano do nervo peroneal, que por sua vez, se estende perpendicularmente à tíbia e lateralmente para baixo da perna abaixo do joelho. No entanto, a variabilidade natural em anatomia entre animais requer vigilância constante para garantir que a colocação do eletrodo é otimizado em base caso-a-caso. Como tal, há um certo nível de tentativa e erro relacionado com a colocação do eléctrodo que é significativamente diminuída pela experiência do utilizador. O número de vezes que os eléctrodos de perfurar a pele deve ser minimizada para reduzir o inchaço e a inflamação, que me diminuiprodução de força asured. Isto é dependente de onde as agulhas são colocadas inicialmente, mas recomenda-se para mover as agulhas de duas vezes ou menos particularmente na área ao redor da rótula. Finalmente, uma vez que os eléctrodos são colocados na perna do animal, pequenos ajustes podem ser feitos para o posicionamento da perna e da corrente fornecida através dos eléctrodos. Isto deve ser feito durante o monitoramento simultâneo a força produzida a partir de uma única contração. Além disso a colocação do eléctrodo, adaptações também podem ser feitas para a tensão fornecida através dos eléctrodos. No entanto, na configuração descrita aqui, é importante ter cuidado quando se aumenta a tensão, como uma maneira para aumentar a produção de força, porque o aumento de tensão irá estimular os nervos que inervam músculos antagonistas. Há três preocupações técnicas fundamentais que devem ser monitorados para garantir que a colocação do eletrodo mantém adequada. Em primeiro lugar, o pé do animal anestesiado deve ser firmementeancorada ao aparelho de pedal, o qual mede a produção de força muscular (Figura 2). Se o pé não está firmemente ancorada, a verdadeira força produzida pelo músculo pode ser incompleta traduzido para o transdutor de força. Fixação instável pé também apresenta o risco de perder o posicionamento ideal dos eléctrodos como o movimento para além contracção muscular normal (ou seja, o pé afastando-se da platina) pode causar o deslocamento dos eléctrodos a partir de sua posição superficial ou desalojar-los completamente. Ambos os cenários irá diminuir a força medida. Em segundo lugar, o corpo do animal deve ser completamente supina e alinhados num plano direito (Figura 2). O posicionamento correto do corpo animais impede ligeiros movimentos da perna devido à respiração, e também minimiza a torção da perna e da pelve, permitindo um melhor posicionamento e contínuo contato dos eletrodos estimulantes. Em terceiro lugar, o posicionamento correto e ancoragem do joelho é critical para assegurar que a perna permanece constante, e assim, ajuda a estabilizar o posicionamento ideal dos eléctrodos estimulantes para permitir a activação consistente do nervo peroneal. Existem alguns pontos adicionais que devem ser enfatizados. Em primeiro lugar, o sistema de alavanca músculo comercial é concebido para realizar testes sobre a perna esquerda, no entanto, a configuração pode ser modificada para realizar testes sobre a perna direita, bem. Em segundo lugar, os sistemas de alavanca de músculo pode ser escolhido com base no tamanho do animal, de modo que os utilizadores devem assegurar que a plataforma utilizada é adequada para medir e suportar a força produzida pelo modelo animal de escolha. músculos testáveis ​​para a plataforma equipamentos são limitados aqueles que induzem a extensão plantar ou dorsiflexão do pé. Em terceiro lugar, ele deve novamente ser enfatizado que a colocação do eletrodo pode ser desafiador e requer paciência e prática para dominar a técnica. Eletrodos também tornar-se aborrecido rapidamente com o uso regular, por isso, é útil ter várias s peçasets por uma vez torna-se difícil para picar a pele superficialmente. Em terceiro lugar, o protocolo descrito no presente relatório utiliza sequências de estimulação e procedimentos específicos de análise de dados. A alavanca do músculo software de controle de sistema e de dados software de análise e os dados que ele fornece podem responder a muitas outras questões experimentais e, portanto, sua utilidade se estende para além do que é aqui descrito. Como tal, os usuários são encorajados a explorar além dos limites do protocolo (s) de software apresentado neste artigo. Apesar destas limitações menores, em testes de função muscular in vivo é uma abordagem poderosa para determinar a capacidade de saúde e contrátil do músculo esquelético, porque é minimamente invasivo e pode ser realizada em várias ocasiões, ao longo de um período de tempo prolongado, no mesmo animal. Em suma, este tipo de utilitário reparadas torna o sistema particularmente hábeis em testar os efeitos de novas terapias para lesão do músculo esquelético ou doença no membro posterior de rato.

Músculo esquelético tem uma capacidade intrínseca notável para reparação em resposta a lesão ou doença 1,2. Experimentalmente, a robustez desta resposta regenerativa tem sido bem documentada em modelos animais por estudar, por exemplo, o curso de tempo de danos do músculo esquelético, a regeneração e reparação depois da aplicação de miotoxinas (por exemplo, cardiotoxina) 3-7. Mais especificamente, após extensa lesão muscular induzida por cardiotoxina (38-67% de fibras musculares 8), a regeneração é mediada por células satélite, as células estaminais residentes que amadurecer para finalmente tornar-se fibras musculares funcionais 4,9-13. O resultado final é o aumento pós-danos regeneração funcional, o tecido muscular produtoras de força saudáveis 14-16. Embora os detalhes estão bem além do escopo deste relatório, o mecanismo de base para a regeneração muscular reflete os eventos cuidadosamente orquestrada de numerosos tipos de células de várias linhagens utilizando canoniCAL vias de sinalização crítica para o desenvolvimento tanto de tecidos e morfogénese 5,17-21. É importante ressaltar que a regeneração induzida por miotoxina está habilitado pelo fato de que a matriz extracelular, inervação neuronal e perfusão dos vasos sanguíneos permanecem estruturalmente intacta seguinte lesão muscular induzida por cardiotoxina 3,8,22. Em contraste, estas estruturas de tecidos e componentes principais são, por definição, totalmente ausente no contexto da lesão VML; onde a perda de Frank de tecido, devido a uma variedade de causas, resulta em défices funcionais e cosméticos permanentes 23-25. Independentemente dos desafios adicionais associados com a reparação e regeneração muscular após lesão VML em comparação com lesão muscular induzida por miotoxina, uma melhor compreensão do mecanismo de base para a regeneração do músculo esquelético e reparação, em uma variedade de contextos, seriam bem servido por utilização de biologicamente modelos animais relevantes em combinação com um longitudinalssessments de medidas funcionais pertinentes. Tal como aqui discutido, os estudos sobre o membro posterior de rato proporcionam um excelente sistema modelo para este fim. Mais especificamente, os músculos do compartimento crural anterior (tibial anterior, extensor digitorum longus (EDL) e hallicus longus (HL)), que são responsáveis ​​pela flexão dorsal do pé, são facilmente identificadas e manipuladas. Além disso, eles são servidos por grandes vasos sanguíneos (ilíacas e ramos), e são inervados por nervos (ciático e filiais, incluindo peroneal) a todo o comprimento da perna 26-28. Como tal, pode-se utilizar o modelo de membro posterior de ratos para avaliar diretamente músculo esquelético função / patologia in vivo, ou para avaliar o impacto mais indireto de alterações relacionadas com a patologia nos vasos sanguíneos ou nervos na função muscular esquelética correspondente. Em qualquer um dos cenários, a gravidade da doença, bem como a eficácia do tratamento pode ser determinada como uma função da produção de força muscular (binário) e correspondente pé movement 29-34. Idealmente, medidas de força são acompanhados por estudos histológicos e expressão gênica análises para avaliar com mais rigor o estado estrutural e molecular do músculo esquelético. histologia básica e imuno-histoquímica, por exemplo, são capazes de responder a perguntas sobre o tamanho do músculo, o alinhamento das fibras musculares, composição da matriz extracelular, localização de núcleos, número de celular, e localização de proteínas. A análise da expressão do gene, por sua vez, é necessária para a identificação dos mecanismos moleculares que podem influenciar / modulam a maturidade das fibras musculares, estados de doença, e actividade metabólica. Embora estes métodos fornecem informações cruciais, eles geralmente representam endpoints terminais, e mais importante, eles não conseguem abordar diretamente a capacidade funcional do músculo esquelético e, portanto, são correlativos em vez de causador. No entanto, quando os estudos histológicos e as análises de expressão de genes são avaliados em conjunto com MEASUR funcionalES, em seguida, os mecanismos de produção de força e a regeneração funcional pode ser identificado de forma mais precisa. A este respeito, a força de produção de capacidades de um músculo pode ser medida in vitro, in situ ou in vivo. Todas as três abordagens têm vantagens e limitações. Em uma experiência in vitro, por exemplo, o músculo é completamente isolado e removido do corpo do animal. Ao eliminar as influências dos vasos sanguíneos e os nervos que alimentam o músculo, a capacidade contráctil do tecido pode ser determinada em um ambiente externo rigorosamente controlada 35. No teste muscular in situ permite que o músculo a ser isolado, como com preparações in vitro, no entanto , a inervação e suprimento de sangue permanecem intactos. A vantagem do modelo experimental in situ é que ele permite um músculo indivíduo a ser estudado, enquanto a inervação e fornecimento de sangue está perturbado minimamente 36. Em ambosin vitro e em experiências in situ, tratamentos farmacológicos podem ser aplicados mais directamente, sem ter que conta para os efeitos de quaisquer tecidos circundantes ou o impacto do sistema circulatório nas respostas contrácteis medidos 37. No entanto, em testes de função in vivo, tal como aqui descrito, é a técnica menos invasivo para avaliar a função do músculo no seu ambiente nativo 38, e pode ser realizada repetidamente ao longo do tempo (isto é, longitudinalmente). Como tal, será o ponto focal da discussão abaixo. A este respeito, percutâneas eléctrodos inseridos perto do músculo de interesse, ou o nervo motor que serve isso, fornecer um sinal eléctrico para o músculo. Um transdutor seguida, mede o comprimento ou a força resultante alterações no músculo ativado como dirigidos por um protocolo de software personalizado predeterminado. A partir destes dados, podem ser determinadas as propriedades físicas do músculo. Estas incluem, porce-frequência, tétano máxima, força-velocidade, rigidez, comprimento tensão e fadiga. comprimento do músculo ou a força também pode ser mantido constante para que o músculo se contrai isometrically ou isotonicamente. Mais importante, estes protocolos experimentais podem ser realizados rapidamente, facilmente repetida, e customized- tudo ao mesmo tempo que o animal é anestesiado e com um período de recuperação de horas a dias. Um único animal pode sofrer em vigor vivo testando várias vezes, permitindo assim estudos longitudinais de modelos ou avaliação de plataformas terapêuticas / tecnologias de doença. Tal como aqui descrito, um sistema de alavanca de músculo comercial em conjunção com uma alta potência, estimulador bi-fase é utilizado para executar em testes de função muscular in vivo para avaliar a contribuição do músculo tibial anterior do membro posterior de rato a flexão dorsal do pé através da estimulação de o nervo fibular. Nós desenvolvemos um protocolo que é especificamente desenhado para avaliar a medicina regenerativa / titecnologias de engenharia ssue para a reparação muscular após lesão VML traumática do rato músculo TA. Deve notar-se; a EDL e HL precisa ser dissecado para fora do compartimento crural anterior para avaliar especificamente o músculo TA (que representam cerca de 15-20% do torque total tibial anterior medido após a estimulação do nervo fibular (Corona et al., 2013) ). Como essa abordagem fornece uma análise longitudinal abrangente do músculo fisiologia / função, ele pode lançar importante visão mecanicista em vários outros tipos de investigações fisiológicas, bem como uma variedade de doenças ou áreas terapêuticas 39. Por exemplo, em testes de função do músculo vivo é aplicável a estudos de fisiologia do exercício, a isquemia / reperfusão pesquisa, miopatia, lesão do nervo / neuropatia e vasculopatia, sarcopenia, e distrofias musculares 40.

<table><tbody><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>05260-04-04</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Inlet Adaptor for Vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>911124</td><td></td></tr><tr><td>Outlet Adaptor for Vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>911125</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Anaesthesia Machine</td><td>Vet Equip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Compressed oxygen gas</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VaporGuard Activated Charcoal Filter</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Professional water heater</td><td>Stryker</td><td>N/A</td><td>set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature</td></tr><tr><td>Transpore Surgical Tape</td><td>3M</td><td>1527S-1</td><td>rip in half to make thinner strips</td></tr><tr><td>A5 Golden animal clippers</td><td>Oster</td><td>078005-050-002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Solution</td><td>Aplicare</td><td>82-227K</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Swabs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>Decon labs</td><td></td><td>diluted to 70% with deionized water</td></tr><tr><td>cotton tipped applicators</td><td>Puritan</td><td>836-WC</td><td></td></tr><tr><td>Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>111-725-24TP</td><td></td></tr><tr><td>servomotor</td><td>Cambridge Technology</td><td>Model 6650LR</td><td></td></tr><tr><td>Dual Mode Lever System</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 305C-LR-FP</td><td>contact manufacturer to order</td></tr><tr><td>Signal Interface</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 604A</td><td></td></tr><tr><td>High-Power, Bi-Phase Stimulator</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 701C</td><td></td></tr><tr><td>Data analysis software</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMAv5.110 software</td><td></td></tr><tr><td>Muscle lever system control software</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMCv5.400 software</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair

Apesar da capacidade regenerativa do músculo esquelético, déficits funcionais e / ou cosméticos permanentes (por exemplo, perda de massa muscular volumétrico (VML), resultante de lesões traumáticas, doenças e diversas doenças congénitas, genéticas e adquiridas são bastante comuns. A engenharia de tecidos e tecnologias de medicina regenerativa têm enorme potencial para fornecer uma solução terapêutica. no entanto, a utilização de modelos animais biologicamente relevantes em combinação com avaliações longitudinais de medidas funcionais pertinentes são críticos para o desenvolvimento de melhores terapias de regeneração para o tratamento de lesões VML-like. a este respeito, um sistema de alavanca de músculo comercial pode ser usado para medir o comprimento, tensão, força e parâmetros de velocidade no músculo esquelético. Utilizou-se este sistema, em conjunto com uma potência elevada, estimulador bi-fase, para medir in vivo a produção de força em resposta à activação do compartimento crural anterior do o membro posterior de ratos. Temos Previamente usado neste equipamento para avaliar o impacto funcional de lesões VML no músculo tibial anterior (TA), bem como a extensão da recuperação funcional após o tratamento do músculo TA feridos com a nossa tecnologia de engenharia de tecidos de reparação do músculo (TEMR). Para tais estudos, o pé esquerdo de um rato anestesiado está firmemente ancorada a uma platina ligados a um servomotor, e do nervo fibular comum é estimulado por dois eletrodos de agulha percutânea para provocar a contração muscular e flexão dorsal do pé. A contração do músculo fibular do nervo induzido por estimulação é medida ao longo de uma gama de frequências de estimulação (1-200 Hz), para garantir uma eventual patamar na produção de força que permite uma determinação precisa da força tetânica máxima. Para além da avaliação da extensão da lesão VML, bem como o grau de recuperação funcional a seguir ao tratamento, esta metodologia pode ser facilmente aplicado para estudar diversas aspectos da fisiologia muscular e patofisiologia. Tal abordagem should ajudar com o desenvolvimento mais racional de terapias melhoradas para a reparação e regeneração muscular.

A curva tetânica podem ser utilizados para distinguir os melhores resultados a partir de resultados sub-óptimos. Esta curva geralmente começa a formar a uma frequência de 60 Hz. O factor chave para a obtenção de bons resultados, é a capacidade de estimular o músculo de modo que ele produz a sua força máxima e mantém a força que durante o tétano. A curva ideal deve ter, de uma ascensão ininterrupta afiado, vertical, no momento da estimulação, seguido por uma fase de plateau plana com oscilações mínimas, e, um período ininterrupto diminuição acentuada vertical no término da estimulação (Figura 4). Desvios da curva ideal indícios de que o músculo está cansado (Figura 5D) ou que o músculo não está a ser devidamente estimulado a produzir força máxima (Figura 5B - C). Este último geralmente resulta da colocação de eletrodos incorreta levando à insuficiência do recrutamento máximo de fibras musculares durante a estimulaçãoção. Uma característica distintiva que permite ao investigador para determinar se uma curva não-ideal é o resultado da colocação do eléctrodo incorrecta ou alterações patológicas para o músculo é se ou não a curva tetânica é completa (fundido) ou incompleta (não fundido). Um, curva tetânica incompleta não fundido indica que os eléctrodos são extraviado, resultando no músculo não tendo uma contracção máxima. Um exemplo de uma alteração patológica no músculo pode ser observado como uma diminuição da contração máxima, em comparação com o controlo, ou uma resposta contráctil que cansa mais rapidamente. Os três tipos diferentes de picos obtidos no decurso deste procedimento representar diferentes posições de eléctrodos e da perna e pode ser visto na Figura 3. Os primeiros picos será de cerca de 0,4 N e ocorrem quando a colocação do eléctrodo correcta é determinada superficialmente sobre a pele (Figura 3A). O segundo conjunto de picos tem hamplitude de grau superior, geralmente em torno de 0.5-0.6N (Figura 3B) e ocorrem quando os eléctrodos perfurar através da derme. Após estes são obtidos, a perna e o pé são ajustadas para maximizar a produção de força, a qual é obtida quando o pico de amplitude aumenta para aproximadamente 1N ou maior (Figura 3C). Neste ponto, Instant Stim pode ser desligado e a sequência pode começar. Essas diretrizes garantir resultados precisos e reprodutíveis e são checkpoints-chave em todo o protocolo. Os resultados finais pode ser representado de diversas maneiras, dependendo da informação que o utilizador extraiu-se a partir do teste de força e do desenho experimental. Neste protocolo, a força máxima é medida através de todas as frequências de estimulação, no entanto outros pontos de dados pode ser importante para um determinado pesquisador ou aplicação. Um exemplo é a frequência de estimulação em que a curva tetânica começa a tomar forma. Tele dados podem ser comparados com outros resultados obtidos a partir de uma experiência anterior ou posterior no mesmo animal, ou para as comparações entre os diferentes grupos de tratamento. produção de força pode ser normalizado pela massa corporal para calcular a força isométrica e fornecer uma avaliação mais imparcial do impacto da idade sobre a contração máxima observada. Embora os animais de diferentes peso corporal e idade vai produzir várias forças máximas, a forma da curva tetânica deve ser consistente entre todos os grupos, quando o procedimento é realizado correctamente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig1.jpg" /> Figura 1: Resumo das funções do sistema de alavanca e software de análise de dados para análise (A) Visão geral do software de controle ao abrir o programa.. (B) Parâmetros para &quot;Stim instantânea.&quot; (C) sequência Exemplo para a estimulação força-freqüência. (D </strong&gt;) Os dados representativos de uma análise de frequência força de alto rendimento no software de análise. Note-se que o procedimento de análise de exemplo sequência e dados é específico para este protocolo e não representam toda a gama de sequências e saídas que são fornecidos por este software. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig2.jpg" /> Figura 2: Aspectos Críticos para o posicionamento do Rato eo posicionamento do pé no aparelho (A) O rato está em uma posição supina com o pé esquerdo, firmemente agarrado à platina.. Os ângulos retos feitas pelo pé, perna e coxa são circuladas. (B) O ângulo direito criado pelo tornozelo é realçado. (C) A perna deve<html> ser alinhados em um plano direto do pé para o corpo. (D) A colocação do eletrodo é paralelo e perpendicular ao plano do nervo peroneal. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig3.jpg" /> Figura 3: Picos representativos demonstrando a importância da correta colocação de eléctrodos para máxima força pico de produção respostas tetânica linha de base (A) observados com eletrodos colocados muito superficialmente.. (B) picos maiores, com eletrodos inseridos no lugar correto. (C) A transição de picos maiores de sinalização colocação do eletrodo correto para óptima pré-sequência de amplitude de pico, como as posições das pernas e dos pés são perfeitamente ajustados./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig4.jpg" /> Figura 4:. Curve tetânico Optimal a 100 Hz Esta curva aumenta e diminui de forma acentuada e tem uma fase de planalto. Este exemplo indica a colocação do eletrodo correto e estimulação força máxima. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig5.jpg" /> Figura 5:. Exemplos representativos de Curves tetânicas Sub-ótima obtida a 100 Hz (a) após relaxamento, essa curva cai abaixo da linha de base. Isto é indicativo de estimulaçãode antagonistas. (B - D) Estes gráficos são o resultado da colocação de eletrodos imprópria e recrutamento desigual das fibras musculares. As fases de planalto demonstram grandes oscilações (B), uma inclinação ascendente (C), ou uma inclinação para baixo (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

applications-vivo-functional-testing-rat-tibialis-anterior-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

13.8K visualizações.  University of Virginia. We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration. 

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An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and physical exam alone, however the clinical presentation can vary greatly depending on the extent of injury, the patient's pain tolerance, etc. In patients with muscle injury or muscle disease, assessment of muscle damage is typically limited to clinical signs, such as tenderness, strength, range of motion, and more recently, imaging studies. Biological markers, such as serum creatine kinase levels, are typically elevated with muscle injury, but their levels do not always correlate with the loss of force production. This is even true of histological findings from animals, which provide a "direct measure" of damage, but do not account for all the loss of function. Some have argued that the most comprehensive measure of the overall health of the muscle in contractile force. Because muscle injury is a random event that occurs under a variety of biomechanical conditions, it is difficult to study. Here, we describe an in vivo animal model to measure torque and to produce a reliable muscle injury. We also describe our model for measurement of force from an isolated muscle in situ. Furthermore, we describe our small animal MRI procedure.

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo animal model of injury is described. The method takes advantage of the subcutaneous position of the fibular nerve. Velocity, timing of muscle activation, and arc of motion are all pre-determined and synchronized using commercial software. Post injury changes are monitored in vivo using MR imaging/spectroscopy.

Um In vivo Modelo de Contração de roedores induzida por lesões e não-invasivos acompanhamento da recuperação

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

Medicina

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Bioengenharia

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across species, combined with the limited healing properties of this tissue, have prompted the search for cellular therapies and propelled the development of experimental models to study their efficacy. Umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells (UCM-MSC) are appealing candidates because they are abundant, easy to collect, circumvent the ethical concerns and risk of teratoma formation, yet resemble primitive embryonic stem cells more closely than adult tissue-derived MSCs. Significant interest has focused on chitosan as a strategy to enhance the properties of MSCs through spheroid formation. This paper details techniques to isolate UCM-MSCs, prepare spheroids on chitosan film, and analyze the effect of spheroid formation on surface marker expression. Consequently, creation of a bilateral patellar tendon injury model in rats is described for in vivo implantation of UCM-MSC spheroids formed on chitosan film. No complication was observed in the study with respect to morbidity, stress rising effects, or tissue infection. The total functional score of the operated rats at 7 days was lower than that of normal rats, but returned to normal within 28 days after surgery. Histological scores of tissue-healing confirmed the presence of a clot in treated defects evaluated at 7 days, absence of foreign body reaction, and progressing healing at 28 days. This bilateral patella tendon defect model controls inter-individual variation via creation of an internal control in each rat, was associated with acceptable morbidity, and allowed detection of differences between untreated tendons and treatments.

This paper describes the preparation and evaluation of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells spheroids with a bilateral patellar tendon defect model in a rat. This model was associated with an acceptable morbidity and was found to detect differences between untreated and treated tendons, and between the two treatments tested.

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E músculo tibial anterior<em&gt; Em situ</em&gt; Em Ratos

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Biologia

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively affect skeletal muscle. This can result in a loss of muscle mass (atrophy) and/or loss of muscle quality (reduced force per unit of muscle mass), both of which are prevalent in chronic disease, muscle-specific disease, immobilization, and aging (sarcopenia). Skeletal muscle function in animals can be evaluated by a range of different tests. All tests have limitations related to the physiological testing environment, and the selection of a specific test often depends on the nature of the experiments. Here, we describe an in vivo, non-invasive technique involving a helpful and easy assessment of force frequency-curve (FFC) in mice that can be performed on the same animal over time. This permits monitoring of disease progression and/or efficacy&#160;of a potential therapeutic treatment.

Measurement of rodent skeletal muscle contractile function is a useful tool that can be used to track disease progression as well as efficacy of therapeutic intervention. We describe here the non-invasive, in vivo assessment of the dorsiflexor muscles that can be repeated over time in the same mouse.

Avaliação não-invasiva da função de músculos levantadores em ratos

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Carga Mecânica Cíclica para Indução de Tendinopatia no Tendão de Aquiles de Ratos

A Passive Ankle Dorsiflexion Testing System for an In Vivo Model of Overuse-induced Tendinopathy

Tendinopathy is a chronic tendon condition that results in pain and loss of function and is caused by repeated overload of the tendon and limited recovery time. This protocol describes a testing system that cyclically applies mechanical loads via passive dorsiflexion to the rat Achilles tendon. The custom-written code consists of pre- and post-cyclic loading measurements to assess the effects of the loading protocol along with the feedback control-based cyclic fatigue loading regimen. 
We used 25 Sprague-Dawley rats for this study, with 5 rats per group receiving either 500, 1,000, 2,000, 3,600, or 7,200 cycles of fatigue loads. The percentage differences between the pre- and post-cyclic loading measurements of the hysteresis, peak stress, and loading and unloading moduli were calculated. The results demonstrate that the system can induce varying degrees of damage to the Achilles tendon based on the number of loads applied. This system offers an innovative approach to apply quantified and physiological varying degrees of cyclic loads to the Achilles tendon for an in vivo model of fatigue-induced overuse tendon injury.

Autor em destaque: Integrando análises mecânicas e biológicas na pesquisa de tendinopatia 

This protocol presents a testing system used to induce quantifiable and controlled fatigue injuries in a rat Achilles tendon for an in-vivo model of overuse-induced tendinopathy. The procedure consists of securing the rat's ankle to a joint actuator that performs passive ankle dorsiflexion with a custom-written MATLAB script.

Um Sistema de Teste de Dorsiflexão de Tornozelo Passivo para um Modelo In Vivo de Tendinopatia Induzida por Overuse

Tendinopathy is a chronic tendon condition that results in pain and loss of function and is caused by repeated overload of the tendon and limited recovery ...

Fabricação de conjuntos de tendões de camundongos para estudar interações celulares em doenças

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de tendões desenvolvendo conjuntos de camundongos para entender os mecanismos celulares

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

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Um In vivo Modelo de Contração de roedores induzida por lesões e não-invasivos acompanhamento da recuperação

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos

Avaliação não-invasiva da função de músculos levantadores em ratos

Um Sistema de Teste de Dorsiflexão de Tornozelo Passivo para um Modelo In Vivo de Tendinopatia Induzida por Overuse

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Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

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