The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Nota: O seguinte protocolo foi concebido para a purificação de um complexo a partir de 4 L de cultura de células, aproximadamente 40 g de peso molhado de células. Uma vez preparada, todos os tampões devem ser armazenadas a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês da sua preparação. Redutores inibidores de protease e agente são apenas adicionados aos buffers imediatamente antes da utilização. 1. Preparação do extracto celular total para purificação de afinidade em tandem <ol><li> Crescimento de S. células cerevisiae <ol><li> Streak a TAP desejado marcado S. cerevisiae do armazenamento (-80 ° C) em uma dextrose de levedura peptona (YPD) placa. Incubar durante 3 - 5 dias (30 ° C), até que as células fúngicas aparecem em branco e fofo. </li><li> Inocular uma sequência de cerca de 2 mm 2 das células frescas de placa em 10 ml de meio YPD em um tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Agitar o tubo a 180 revoluções por minuto (rpm) durante a noite (30m ° C). </li><li> Inocular 2 ml da sobrecultura noite, por litro de meio YPD em um L Erlenmeyer 2 ou frasco cónico. Agitar a 180 rpm (30 ° C). Monitorizar o crescimento celular a uma densidade óptica de 600 nm (OD 600) até a fase log tardia, OD 600 entre 1,8 e 2, tipicamente 20-24 horas. </li></ol></li><li> Colheita S. células cerevisiae <ol><li> Células colheita por centrifugação a 5400 xg durante 15 minutos (4 ° C). </li><li> decantar o sobrenadante rapidamente e manter as células a 4 ° C ou sobre gelo. </li><li> Suspender cada litro de pelete de células com 2 ml refrigeradas tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; EDTA 0,2 mM, pH 8,0; imidazole 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v de NP-40 / v). Suspender as células por agitação e / ou de repetição pipetagem usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Nota: A importância de NP-40 no que se refere à qualidade do complexo e a análise pós-purificação é discutido abaixo. </li><li> Transferir a suspensão de células para um vazio de 50 ml de polipropileno cónico tubo de centrífuga KEPT no gelo. Lava-se cada frasco de centrífuga com um adicional de 2 ml de tampão de lise arrefecida e adicionar a suspensão de células no tubo de 50 ml. </li><li> Determinar o peso húmido do sedimento celular por pesagem do tubo e subtraindo o peso do tubo vazio, bem como o tampão de lise adicionado. Nota: Um litro de cultura de células tendo uma densidade óptica de 1,8 a 600 é de aproximadamente 10 g. </li><li> Criar um banho de azoto líquido num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Desenhar células em suspensão em uma seringa de 5 ml. Conectar uma agulha G 16 da seringa. Congelar a suspensão de células por passagem através de seringa / agulha para gerar células de &quot;gotículas&quot;. Velocidade de congelação deve ser de aproximadamente 1 min / mL. </li><li> Armazenar gotículas de células congeladas (-80 ° C) ou proceder à lise. </li></ol></li><li> Lise Células e Lysate Esclarecimento <ol><li> Lyse as células de levedura usando um moedor de café. células Lyse oito a nove vezes com 25 segundos de moagem rajadas, agitando o cmoedor offee. Antes de usar, pré-resfriar o moedor de café com nitrogênio líquido. De dois em dois ciclos de moagem, adicionar uma camada superficial de azoto líquido para o moinho e permitir que ela se evapore. </li><li> Mexa com uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado como necessário para manter as células de aglomeração. Tome cuidado para evitar o descongelamento das células, o que pode resultar em agregação celular. As células devem aparecer como um pó branco fino após a lise. Uma pelete de células máximo de 4 L de cultura de levedura (~ 40 g) pode ser moído de cada vez. Nota: Observações sobre método de lise são discutidas abaixo. </li><li> Avaliar o grau de lise de células utilizando um hemocitómetro ou método de contagem celular alternativa. Para fornecer uma análise adequada, tomar as seguintes amostras: (1) antes de lise; (2) após quatro rondas de lise; e (3) após a lise. Para verificar essas amostras, tomar uma pequena quantidade de células com um nitrogênio espátula refrigerados líquido e coloque em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Uma vez que as células são descongeladas, de pipeta 5 ul de célulase misturar com 495 ul de água. Se 40 - é observada 60% de lise de células, avance para o próximo passo no protocolo. Nota: Observações relativas efeito de longos períodos de lise são discutidos abaixo. </li><li> Uma vez lise adequada é observada, loja lisadas células (-80 ° C) ou prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Preparar dois tubos de 50 ml de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml, cada um com um tampão de lise, incluindo 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e um cocktail comercialmente disponíveis de inibidores de protease. Nota: Se a proteólise é observada significativa, considerar o uso de uma estirpe deficiente em protease. </li><li> Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para colher o pó de células lisadas congelada nos preparados tubos de 50 ml. Adicionar o pó celular / sólido incrementalmente ao tampão de lise, contendo tanto um redutor e inibidor (es) da protease. </li><li> Rodar os tubos de 50 ml suavemente à TA, a fim de descongelar / dissolver as células, mas também para evitar a formação de bolhas. UMAé o pó celular / sólido dissolve-se, adicione célula adicional sólido / pó. </li><li> Encher cada um dos dois tubos de 50 ml até que cada um tem aproximadamente 20 g de células ou todas as células adicionadas. Continuar a descongelação / dissolve-se até que não existam aglomerados de células congeladas observadas nos tubos de 50 ml. Isso deve levar cerca de 50 min. </li><li> Centrifuga-se o ligado de células em suspensão durante 20 minutos a 25000 xg (4 ° C). Bem células lisadas podem apresentar uma pequena quantidade de precipitado negro. </li><li> Transferir os 50 ml de sobrenadante para policarbonato tubos ultra-centrifugação (26,3 ml tubos usados) e adicionar 10 ul PMSF 200 mM a cada tubo cheio. </li><li> Centrifugar durante 1 h a 100000 xg (4 ° C). Quatro camadas deve ser visível, de baixo para cima: (1) um sedimento duro clara, contendo complexos ribossomais; (2) um sedimento macio ricos em lípidos; (3) uma grande camada amarelo-clara tingido contendo a maioria de proteínas e complexos solúveis da célula; e (4) uma camada de topo &#39;escamosa&#39; que consiste em lípidos. </li><li> Executar todas as spassos ubsequent em uma sala fria (4 ° C). Remover o máximo da camada lipídica topo &#39;escamosa &quot;quanto possível, utilizando uma pipeta de 1 mL e rejeitar. Usar uma pipeta de 10 ml serológico para recuperar a maior parte da camada amarelo, claro. </li><li> Recuperar os últimos ml desta camada usando uma pipeta de 1 ml para evitar perturbar as duas camadas inferiores. A partir de 40 g de sedimento celular húmido, cerca de 48 ml da camada do meio é tipicamente recuperado e 8 ml de camada lipídica removido / descartado. Nota: A purificação em coluna de fluxo é muito dificultado pela presença de lípidos, que também pode reduzir a qualidade do complexo, discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 2. Coluna etapa de purificação 1: IgG Cromatografia <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Prepare um 300 ml IgG Sepharose suspensão por 40 g de sedimento celular. Cortar a extremidade de uma pipeta de 1 ml de ponta para facilitar a pipetagem da lama. Lavagem / equilibrar a resina de IgG três vezes, cada vez com 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl a 150 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; 1 mM de DTT; um comprimido de inibidor de protease por 50 ml de volume). <ol><li> Centrifugação para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre as lavagens e remover o sobrenadante. </li></ol></li><li> Girar a resina de IgG com o sobrenadante da fase de meio e dois comprimidos de inibidor de protease de mini por 40 g de células, utilizando um rotor adequado, durante 2 h (4 ° C). Esta é a solução do lote de IgG. </li><li> Prepare duas colunas de 10 ml de poli-prep para utilização, cortando a extremidade da coluna para produzir um corte plano. Para acelerar a embalagem e lavagem da coluna de fluxo por gravidade, carregar um máximo de 200 ul de IgG de resina embalada ou ~ 25 ml da solução de lote de IgG por 10 ml de coluna. </li><li> Verter a solução do lote de IgG à coluna e permitir a sedimentar por gravidade. Se a sedimentação demora mais do que 30 minutos, não mais provável era a contaminação lipídica ao recuperar a fase intermédia do centrifugador tUBEs. </li><li> Lava-se a coluna empacotada com quatro sucessivos volumes de 10 ml de Tampão IgGD150. </li></ol></li><li> Por clivagem de TEV Coluna <ol><li> Selar o fundo da coluna e adicionar 1 ml de tampão IgGD150 e 100 ul de protease de TEV (0,6 mg / ml, variante mutante S219V de TEV produzido internamente). Fecha-se o topo da coluna e mistura-se durante 20 min (18 ° C) usando um misturador térmico, agitando a 750 rpm. Ressuspender a resina e misturar outra vez durante 20 minutos, repetir uma vez mais para um total de 1 hora de incubação. Nota: É crítico para manter o tempo de incubação para um mínimo. </li><li> Retorno da coluna a 4 ° C e elui-se a proteína / complexo por gravidade. Eluir o volume morto com um adicional de 200 mL de tampão IgGD150. </li></ol></li></ol> 3. coluna de purificação Passo 2: Cromatografia de Afinidade A calmodulina <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Preparar 200 ul de resina de afinidade com calmodulina por 40 g de célulassedimentar. Lava-se a resina três vezes, cada vez com 5 mL de calmodulina Tampão de Ligação (Tris 10 mM-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugação a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavagem. </li><li> Para cada 1 ml de eluato IgG, adicionar 3 volumes de calmodulina tampão de ligação. Para manter constante o nível de cálcio, adicionar CaCl2 e β-mercaptoetanol para explicar a falta destes componentes na eluição de IgG. As concentrações finais devem ser CaCl2 2 mM e mM β-mercaptoetanol 10. </li><li> Adicionar a amostra para a resina de calmodulina e ligam-se durante 1 hora (4 ° C) usando um rotor tubo. </li></ol></li><li> Embalagens e eluição, da calmodulina Resina <ol><li> Prepara-se uma coluna de 2 ml de poli-prep por 100 ul de suspensão de calmodulina, cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. Carregue não mais do que 100 ï¿½ calmodulina suspensão por column para minimizar a quantidade de resina a amostra entra em contacto durante a eluição com. </li><li> Encher a coluna pela força da gravidade e lava-se a resina na coluna três vezes com 5 mL de calmodulina Binding Buffer. </li><li> Elui-se a proteína com a adição de 200 uL calmodulina eluição tampão (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis vezes a adição de 200 ul de tampão de eluição A calmodulina. </li><li> Para eluições 1 a 3, aplicam-se o volume para a coluna e recolher o eluato imediatamente. Para a eluição 4, vedar a parte inferior da coluna e incuba-se com tampão de eluição durante 2,5 min e, em seguida, desselar e deixa-se eluir por gravidade. Para a eluição 5, incubar durante 5 min e, em seguida, desselar e eluir. Para a eluição 6, incubar durante 10 minutos e, em seguida, desselar e eluir. Nota: A integridade do complexo pode variar entre eluiï¿½es / frações (ver secção resultados representante) &lt;./ Li&gt; <li> Dialisar eluições 2 a 6 individualmente durante a noite utilizando um método de diálise micro apropriado. Dialisar as fracções contra tampão de diálise (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol). Nota: O NP-40 não passam sensivelmente, se de todo, através da membrana de diálise. </li></ol></li></ol> 4. As análises pós-purificação para avaliar a qualidade do Complexo <ol><li> Native Gel e prata Coloração <ol><li> Prepara-se uma 4 - gel nativo prefabricados de 16% para análise do complexo de acordo com as instruções do fabricante. Usar um padrão de proteína de peso molecular apropriado e de carga de 15 ul de cada uma das fracções de calmodulina de eluição / dialisadas no gel. </li><li> Electroforese o gel a 150 V durante cerca de 3 h (4 ° C). </li><li> Silver Stain o gel para avaliar a qualidade de cada uma das seis eluições. Como alternativa, use comercial igualmente sensíveismancha fluorescente (s). Nesta fase, a concentração do complexo é muito provavelmente abaixo do nível de detecção por coloração com azul de Coomassie. </li></ol></li><li> Métodos de análise adicional do gel <ol><li> Para detectar a proteína por transferência de Western, resolver o complexo de SDS ou por PAGE nativa e, em seguida sondar o gel para o epitopo calmodulina Binding Peptide (CBP), utilizando um anticorpo etiqueta TAP de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Usando um corante fluorescente específico (s), confirmar a presença e a integridade de proteínas e / ou ácido nucleico num complexo da torneira purificada. Tome cuidado para que nenhuma sobreposição espectral é detectada entre estas manchas. </li></ol></li><li> Negativo Visualization Stain Electron Microscopy <ol><li> Use grades de carbono contínuas glow-descarregada a -15 mA durante 30 segundos, no prazo de 30 min de aplicação complexa. </li><li> Aplicar 3 ul de TAP complexo purificado (tipicamente a uma concentração de 1 nM) a grade. Incubar durante um minuto. blot fROM O lado da rede para remover o excesso de tampão. </li><li> Lavar duas vezes com 20 gotas de ua desionizada. blot lado entre as lavagens. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa e incubar durante um min. A coloração com acetato de uranilo (2%) ou formato de uranilo (0,75%) é recomendado. Cuidado: sais e soluções uranyl são fracamente radioativa e contêm metais pesados. Estes devem ser manuseados com cuidado e todo o material que entra em contato com estas soluções devem ser eliminados de seguir as orientações de resíduos recomendados institucionais. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa fresco, sem borrar. Incubar durante um minuto, em seguida, blot lado, e, finalmente, o ar seco e visualizar. </li></ol></li><li> Cryo Electron Microscopy (crio-EM) Visualization <ol><li> Execute crio-EM com a TAP purificado complexo, apesar de otimização pode ser necessário, de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: A presença de detergente em concentrações elevadas MAy impedir o progresso e é discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 5. armazenamento Complex <ol><li> Preparando Complexo de Armazenamento <ol><li> Concentra-se o complexo, se necessário, utilizando-se um filtro centrífugo com um peso molecular de corte adequado para o complexo. Girar a 14.000 xg por 1 min incrementos até a concentração desejada seja atingida. Nota: concentração de NP-40 aumentarão em concentração durante a concentração, uma vez que não passa através da membrana do filtro, nem a diálise. </li><li> Flash congelar o complexo em 30 mL alíquotas em azoto líquido ou gelo seco arrefecido banho de etanol e, em seguida, armazena-se a -80 ° C. </li></ol></li><li> Opcional remoção pós-purificação de detergente </li></ol> Nota: A presença de um detergente tal como NP-40 e com uma concentração acima da sua concentração crítica de micelas podem impedir ou inibir o progresso para algumas aplicações. As consequências de sua remoção do protocol, bem como a substituição com outros aditivos ou co-solventes são discutidos abaixo. Se não NP-40 for desejado, uma opção é a utilização de uma aplicação comercial para a remoção de, por exemplo, Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pré-equilibrar disponíveis comercialmente de detergente em grânulos absorventes tampão de diálise. Misture cinco pérolas por 30 ul de complexo (geralmente em concentração de 10 nM). </li><li> Incubar esferas equilibradas do Passo 5.2.1 com TAP complexo purificado durante 15 minutos em gelo. Use complexo dentro de algumas horas após a remoção do detergente. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O método TAP utiliza duas marcas que equilibram a necessidade de rigorosa e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. Além disso, a TAP indivíduo com etiquetas ORFs estão disponíveis a partir de uma fonte comercial, de modo que pode obter-se qualquer estirpe de levedura com um...

Muitos processos celulares importantes são realizadas por grandes complexos de proteínas e de ARN-proteína 1. Um gargalo significativo para a realização de estudos biofísicos e estruturais destes complexos é a sua obtenção de uma qualidade adequada (isto é, a homogeneidade) e numa concentração adequada. Isolamento de um complexo a partir de uma fonte nativa tem muitas vantagens, incluindo a retenção de modificações pós-transcricionais e / ou traducionais relevantes de subunidades e segurar a montagem complexa adequada. No entanto, grandes complexos celulares estão frequentemente presentes em uma célula de um número de cópias baixo e a purificação deve ser altamente eficiente e ocorrem sob condições fisiológicas próximo para assegurar a integridade do complexo é mantido. Purificando um complexo de uma fonte eucariótica é particularmente desafiador e pode ser financeiramente proibitivo. Assim, as estratégias ou métodos que sejam eficientes e produzem um complexo homogênea são altamente desejado. Uma estratégia que tem sidosucesso na purificação complexos nativos de células eucarióticas para sua caracterização inicial é o Tandem Affinity Purification (TAP) Método 2,3. O método TAP foi inicialmente concebido para purificar a proteína nativa a partir da levedura de brotamento (S. cerevisiae) em complexo com a interação dos fatores (s) 2. O método utilizado TAP duas etiquetas, cada etiqueta fundidos em conjunto para a mesma sequência do gene que codifica a proteína. As etiquetas foram seleccionados de forma a equilibrar a necessidade de apertado e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. A etiqueta TAP genomicamente incorporada foi colocada na extremidade (C-terminal) de um gene de codificação da proteína e consistia de uma sequência de codificação para um Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguido de Proteína A - uma adição de pouco mais de 20 kDa ao etiquetado proteína. CBP é curto, 26 aminoácidos, e reconhecido pela ~ 17 kDa de proteína calmodulina (CaM), na presença de cálcio com um K D na ordem de 10 -9 M 4. A Proteína A etiqueta é maior, que consiste de duas repetições de 58 resíduos com um curto ligante entre as repetições. Cada repetição ácido amino 58 é reconhecido pela imunoglobulina G (IgG) com um K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas duas etiquetas foi incorporado um local de reconhecimento para a protease de TEV, uma endopeptidase do Vírus do tabaco Etch 6,7. Tal como ilustrado na Figura 1, no primeiro passo de afinidade do método da TAP etiquetado proteína é ligado a uma resina de IgG através da Proteína A. A proteína é eluída com etiquetas por clivagem em coluna após a adição de protease de TEV, Site-especificamente a clivagem entre as duas marcas. Este é um passo necessário como a interacção de IgG e proteína A é muito forte e pode apenas ser adequadamente perturbado sob condições desnaturantes solução. Na falta de um Protein uma etiqueta, a proteína está ligada a resina CaM na presença de cálcio e eluído a partir desta resina com a adição de EGTA quelante de iões metálicos (ácido tetracético de etileno-glicol) (Figura 1). Logo após a introdução do método da TAP, que foi utilizado num estudo em larga escala para gerar um &quot;mapa&quot; de interacções complexas em S. cerevisiae 8. É importante notar, como uma consequência deste esforço uma biblioteca inteira Quadro levedura-TAP Tagged de leitura aberta (ORF), bem como a TAP indivíduo com etiquetas ORFs 9 estão disponíveis a partir de uma fonte comercial. Assim, pode-se obter qualquer cepa de levedura com uma proteína marcadas para qualquer complexo levedura. O método TAP também estimulou modificações ou variações da etiqueta TAP, incluindo: a sua utilização para a purificação de complexos de outros eucariotas, bem como as células bacterianas 10,11; a criação de uma &quot;tag dividido&quot;, em que a proteína A e PFC são colocados em diferentes proteínas 12; eo taGS alterado, de modo a acomodar a necessidade do investigador, tais como a sensibilidade do complexo de Ca 2+ ou de EGTA 13. Recentes avanços em ambos instrumentação e metodologia levaram a avanços significativos na aplicação de microscopia eletrônica (EM) para determinação da estrutura, que levaram à alta, perto imagens de resolução atômicas de complexos macromoleculares 14. A resolução de um complexo obtido por EM, no entanto, permanece depende da qualidade do complexo em estudo. Este estudo utilizou a abordagem tag TAP para purificar de S. cerevisiae U1 snRNP, um baixo número de cópias do complexo ribonucleoproteico 18 da subunidade (~ 0,8 MDA) que faz parte do spliceossoma 15,16. Um número de passos foram tomados para purificar este complexo de tal forma que é homogénea e de uma concentração adequada. Os potenciais problemas encontrados em várias fases da purificação são descritos e estratégias para superar feita challEnges destaque. Com cuidado avaliar e optimizar etapas na purificação, o U1 snRNP purificado é de uma qualidade e em quantidade adequada para coloração negativa e eletrônica crio microscopia (crio-EM) estudos. Um método TAP protocolo optimizado para a purificação de complexos de nativas para estudos estruturais é aqui descrito.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Used for cell lysis</td></tr><tr><td>Hemocytometer, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Used to assess cell lysis</td></tr><tr><td>JA 9.100 centrifuge rotor&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to harvest the yeast cells</td></tr><tr><td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td></tr><tr><td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to further clear the soluble cell extract</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Temperature controlled shaker</td></tr><tr><td>Novex gel system</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>Calmodulin resin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Affinity resin</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Used to pack and wash the IgG resin</td></tr><tr><td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>NativeMark protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &amp;mu;l for a silver stained gel and 5 &amp;mu;l for a SYPRO Ruby stained gel</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Unstained protein standard used for Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Primary antibody against CBP tag</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis units</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td></tr><tr><td>Detergent absorbing beads</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td></tr><tr><td>Copper grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

abordagens de purificação por afinidade foram bem sucedidos em isolar complexos nativas para a caracterização proteômica. heterogeneidade estrutural e um grau de heterogeneidade de composição de um complexo não costumam impedir o progresso na realização de tais estudos. Em contraste, um complexo destinado a caracterização estrutural deve ser purificado num estado que é tanto em termos de composição e estruturalmente homogénea, bem como a uma concentração mais elevada do que o necessário para proteómica. Recentemente, tem havido avanços significativos na aplicação da microscopia de electrões para a determinação da estrutura de grandes complexos macromoleculares. Isso tem aumentado o interesse em abordagens para purificar complexos nativas de qualidade e quantidade suficiente para a determinação estrutural por microscopia eletrônica. O método Tandem Affinity Purification (TAP) foi otimizado para extrair e purificar a 18 subunidade, ~ 0,8 Mda montagem ribonucleoproteï¿½a a partir de levedura de brotamento (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adequado para coloração negativa e microscopia crio elétron. Aqui está detalhado as modificações feitas com o método TAP, a justificativa para fazer essas alterações, e as abordagens tomadas para ensaio para um complexo de composição e estruturalmente homogênea.

Um método TAP modificado foi usado para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, um complexo ribonucleoproteico-18 subunidade. Uma purificação inicial da TAP complexo seguindo o protocolo publicado 2,3 produziu um complexo que apareceu heterogénea, que migra como três bandas sobre um gel de poliacrilamida corado com prata nativa (Figura 2A). Múltiplos ciclos de optimização do método TAP, produziu um complexo que migrou como uma única ba...

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K visualizações.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando FPLC para purificação eficiente da proteína FEN1 marcada com His

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Otimizando a cromatografia de afinidade para a proteína FEN1 marcada com HIS

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biologia

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Resumo

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Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

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Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Identificação de complexos de proteínas em

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL