The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Nota: Il seguente protocollo è stato ideato per la purificazione di un complesso da 4 L di coltura cellulare, a circa 40 g di peso umido di cellule. Una volta preparato, tutti i buffer devono essere conservati a 4 ° C ed utilizzati entro un mese della loro preparazione. Ridurre gli inibitori della proteasi e agenti vengono aggiunti ai buffer appena prima dell&#39;uso. 1. Preparazione di tutta la cella estratto per Tandem Affinity Purification <ol><li> La crescita di S. cellule cerevisiae <ol><li> Streak TAP desiderata contrassegnata S. ceppo cerevisiae da stoccaggio (-80 ° C) su un destrosio lievito peptone (YPD) piatto. Incubare per 3 - 5 giorni (30 ° C), fino a quando le cellule di lievito appaiono bianchi e soffici. </li><li> Seminare una striscia di circa 2 mm 2 delle cellule fresche dalla piastra in 10 ml supporti YPD in 50 ml conica in polipropilene provetta da centrifuga. Agitare la provetta a 180 giri al minuto (rpm) per una notte (30m ° C). </li><li> Seminare 2 ml di sopracultura notte per litro di supporti YPD in 2 L Erlenmeyer o beuta. Agitare a 180 rpm (30 ° C). Monitorare la crescita delle cellule ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) fino fase logaritmica tardiva, OD 600 di 1,8 a 2, tipicamente 20 - 24 ore. </li></ol></li><li> Raccolta S. cellule cerevisiae <ol><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 5.400 xg per 15 minuti (4 ° C). </li><li> decantare rapidamente il supernatante e mantenere le cellule a 4 ° C o su ghiaccio. </li><li> Sospendere ogni litro di pellet con 2 ml refrigerati Lysis Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM imidazolo, pH 8,0; 10% glicerolo; 0,1% v / v NP-40). Sospendere le cellule da vorticoso e / o ripetere pipettaggio utilizzando una pipetta 10 ml sierologico. Nota: L&#39;importanza di NP-40 in quanto riguarda la qualità e la complessa analisi post-purificazione è discusso qui di seguito. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un vuoto da 50 ml conica in polipropilene tubo da centrifuga kEPT sul ghiaccio. Lavare ogni bottiglia centrifuga con ulteriori 2 ml di tampone di lisi e raffreddato aggiungere alla sospensione cellulare nel tubo 50 ml. </li><li> Determinare il peso umido del pellet cellulare pesando il tubo e sottraendo il peso del tubo vuoto, nonche la aggiunto Lysis Buffer. Nota: Un litro di coltura cellulare avente un diametro esterno 600 di 1,8 è di circa 10 g. </li><li> Creare un bagno di azoto liquido in un 50 ml provetta da centrifuga conica polipropilene. Disegnare cellule sospese in una siringa da 5 ml. Collegare un ago 16 G alla siringa. Bloccare la sospensione cellulare facendolo passare attraverso la siringa / ago per generare cellule &quot;goccioline&quot;. Tasso di congelamento dovrebbe essere di circa 1 min / ml. </li><li> Conservare le goccioline di cellule congelate (-80 ° C) o procedere alla lisi. </li></ol></li><li> Lisi Cellule e lisato Chiarimento <ol><li> Lyse le cellule di lievito con un macinino da caffè. cellule Lisare otto a nove volte con 25 secondi di rettifica scoppi, mentre agitando il csmerigliatrice Offee. Prima dell&#39;uso, pre-raffreddare il macinacaffè con azoto liquido. Ogni due turni di rettifica, aggiungere uno strato superficiale di azoto liquido per il macinino e lasciare evaporare. </li><li> Mescolare con una spatola di azoto liquido refrigerato come necessario per mantenere le cellule di aggregazione. Fare attenzione per evitare lo scongelamento delle cellule, che può risultare in aggregazione delle cellule. Le cellule dovrebbero apparire come una polvere bianca dopo lisi. Un pellet massima cellulare da 4 L di coltura di lievito (~ 40 g) può essere terra alla volta. Nota: Osservazioni sul metodo di lisi sono discussi di seguito. </li><li> Valutare il grado di lisi delle cellule utilizzando un emocitometro o metodo di conteggio delle cellule alternativo. Per fornire un&#39;adeguata analisi, prendere i seguenti esempi: (1) prima di lisi; (2) dopo quattro turni di lisi; e (3) dopo lisi. Per controllare questi campioni, prendere una piccola quantità di cellule con una spatola di azoto raffreddato liquido e posto in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Una volta che le cellule sono scongelati, pipetta da 5 ml di cellulee mescolare con 495 ml di acqua. Se 40 - si osserva il 60% lisi delle cellule, procedere al passo successivo nel protocollo. Nota: Osservazioni sul effetto di lunghi periodi di lisi sono discussi di seguito. </li><li> Una volta adeguata lisi si osserva, negozio lisate cellule (-80 ° C) o passare alla fase successiva. </li><li> Preparare due provette da 50 ml per centrifuga conica polipropilene ciascuna con 15 ml tampone di lisi, tra 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 1 mM ditiotreitolo (DTT), e un cocktail disponibile in commercio di inibitori delle proteasi. Nota: Se si osserva proteolisi significativo, considerare l&#39;uso di una proteasi ceppo carente. </li><li> Utilizzare una spatola di azoto liquido refrigerato per raccogliere la polvere delle cellule lisato congelato nei preparati provette da 50 ml. Aggiungere la polvere di cellule / solido incrementale al Lysis Buffer, contenente sia un riducente e inibitore della proteasi (s). </li><li> Ruotare i tubi 50 ml dolcemente RT modo da scongelare / sciogliere le cellule, ma anche per prevenire la formazione di bolle. UNs la polvere di cellule / dissolve solidi, aggiungere delle cellule ulteriore solido / polvere. </li><li> Riempire ciascuno dei due tubi 50 ml fino ognuno ha circa 20 g di cellule o di tutte le cellule aggiunti. Continuare scongelamento / dissoluzione fino a quando non ci sono grumi di cellule congelate osservati nei tubi da 50 ml. Questo dovrebbe durare circa 50 minuti. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare sospeso per 20 minuti a 25.000 xg (4 ° C). cellule ben lisate possono presentare una piccola quantità di precipitato nero. </li><li> Trasferire i 50 ml di surnatante in policarbonato tubi ultra-centrifuga (26.3 ml tubi usati) e aggiungere 10 ml 200 mm PMSF ad ogni provetta piena. </li><li> Centrifuga per 1 ora a 100.000 xg (4 ° C). Quattro strati devono essere visibili, dal basso verso l&#39;alto: (1) un disco chiaro pellet, contenente complessi ribosomiale; (2) una morbida pallina ricchi di lipidi; (3) un grande livello giallastra trasparente contenente più di proteine ​​e complessi solubili della cellula; e (4) uno strato superiore &#39;squamosa&#39; costituito da lipidi. </li><li> Eseguire tutte le spassi ubsequent in una stanza fredda (4 ° C). Rimuovere la maggior quantità di alto strato lipidico &#39;squamosa&#39; possibile, utilizzando una pipetta 1 ml e scartare. Utilizzare una pipetta ml sierologico 10 di recuperare la maggior parte del colore giallo, strato trasparente. </li><li> Recuperare gli ultimi ml di questo strato con una pipetta 1 ml per evitare di disturbare i due strati inferiori. Da 40 g pellet cellulare bagnato, circa 48 ml di strato centrale è in genere recuperati e 8 ml di strato lipidico rimossi / scartati. Nota: flusso purificazione colonna è fortemente ostacolato dalla presenza di lipidi, che può anche ridurre la qualità del complesso, discusso sotto. </li></ol></li></ol> 2. Purificazione passo Colonna 1: IgG cromatografia <ol><li> Resina Equilibration e rilegatura <ol><li> Preparare una 300 ml IgG Sepharose liquami per 40 g di pellet. Tagliare l&#39;estremità di una punta pipetta 1 ml per facilitare il pipettaggio il liquame. Lavare / equilibrare la resina IgG tre volte, ogni volta con 5 ml IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 0,1% v / v NP-40, 1 mM DTT, una tavoletta inibitore della proteasi per 50 Volume ml). <ol><li> Spin a pellet a 160 g (4 ° C) tra i lavaggi e rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Ruotare la resina IgG con il surnatante fase intermedia e due mini compresse inibitore della proteasi per 40 g di cellule, utilizzando un rotatore appropriata, per 2 ore (4 ° C). Questa è la soluzione lotto IgG. </li><li> Preparare due 10 ml colonne poli-prep uso tagliando la fine della colonna per produrre un taglio piatto. Per accelerare l&#39;imballaggio e lavaggio della colonna mediante flusso per gravità, caricare un massimo di 200 ml di resina IgG imballato o ~ 25 ml della soluzione di lotto IgG per 10 ml di colonna. </li><li> Versare la soluzione lotto IgG nella colonna e lasciar sedimentare per gravità. Se sedimentazione richiede più di 30 minuti, non più probabile era contaminazione lipidico quando recuperare la fase centrale dalla centrifuga tUBE. </li><li> Lavare la colonna imballato con quattro successive 10 ml volumi di IgGD150 tampone. </li></ol></li><li> Sulla colonna di fenditura TEV <ol><li> Sigillare la parte inferiore della colonna e aggiungere 1 ml di IgGD150 tampone e 100 ml di TEV proteasi (0,6 mg / ml magazzino, mutante variante S219V di TEV prodotto in-house). Sigillare la parte superiore della colonna e miscelare per 20 min (18 ° C) utilizzando un miscelatore termico, agitando a 750 rpm. resina Risospendere e mescolare ancora per 20 minuti, ripetere una volta di più, per un totale di 1 ora di incubazione. Nota: E &#39;fondamentale per mantenere il tempo di incubazione al minimo. </li><li> Riportare la colonna 4 ° C ed eluire la proteina / complesso per gravità. Eluire il volume morto con altri 200 ml di IgGD150 tampone. </li></ol></li></ol> 3. colonna di purificazione Fase 2: Calmodulina affinità e cromatografia <ol><li> Resina Equilibration e rilegatura <ol><li> Preparare 200 ml di resina di affinità Calmodulina per 40 g di cellulepellet. Lavare la resina tre volte, ogni volta con 5 ml Calmodulin Binding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 2 mM CaCl 2; 0,1 % v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo), centrifugazione a 160 xg (4 ° C) a pellet per ogni lavaggio. </li><li> Per ogni eluato 1 ml IgG, aggiungere 3 volumi di Calmodulina Binding Buffer. Per mantenere il livello di calcio costante, aggiungono CaCl 2 e β-mercaptoetanolo per spiegare la mancanza di tali componenti, l&#39;eluizione IgG. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 2 mm CaCl 2 e 10 mm β-mercaptoetanolo. </li><li> Aggiungere il campione alla resina Calmodulin e legarsi per 1 ora (4 ° C) usando un rotatore tubo. </li></ol></li><li> Imballaggio ed eluendo da Calmodulina Resina <ol><li> Preparare una colonna poli-prep 2 ml per 100 microlitri slurry Calmodulin tagliando la fine della colonna per creare un&#39;apertura piatta. Caricare non più di 100 ml Calmodulina liquami per colonna per minimizzare la quantità di resina campione viene a contatto con durante l&#39;eluizione. </li><li> Riempire la colonna per gravità e lavare la resina nella colonna tre volte con 5 ml Calmodulin Binding Buffer. </li><li> Eluire proteina con aggiunta di 200 microlitri Calmodulina tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8,0; 4 mM EGTA, pH 8,0; 0,08% v / v NP-40; 10 mM β-mercaptoetanolo). Ripetere sei volte l&#39;aggiunta di 200 ml di tampone di eluizione calmodulina. </li><li> Per eluizioni 1 a 3, applicare il volume della colonna e raccogliere immediatamente l&#39;eluato. Per eluizione 4, sigillare il fondo della colonna e incubare con tampone di eluizione per 2,5 minuti e poi unseal e si eluisce per gravità. Per eluizione 5, incubare per 5 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Per eluizione 6, incubare per 10 minuti e poi rimuovere il sealing ed eluire. Nota: L&#39;integrità del complesso può variare tra eluizioni / frazioni (vedere la sezione rappresentativa risultati) &lt;./ Li&gt; <li> Dializzare eluizioni 2 a 6 singolarmente notte utilizzando un metodo di dialisi micro appropriata. Dializzare frazioni contro Dialysis tampone (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 10 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 5 mM imidazolo, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanolo). Nota: NP-40 non passa sensibilmente, se non del tutto, attraverso la membrana di dialisi. </li></ol></li></ol> 4. Le analisi post-depurazione per valutare la qualità Complex <ol><li> Native Gel e argento colorazione <ol><li> Preparare un 4 - gel nativo prefabbricati 16% per l&#39;analisi del complesso secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare un apposito standard di proteine ​​di peso molecolare e carico 15 ml di ciascuna delle Calmodulina eluizione / frazioni dializzati sul gel. </li><li> Elettroforesi il gel a 150 V per circa 3 ore (4 ° C). </li><li> Argento macchia il gel per valutare la qualità di ciascuna delle sei eluizioni. In alternativa, utilizzare commerciale ugualmente sensibilimacchia fluorescente (s). In questa fase, la concentrazione del complesso è più probabile di sotto del livello di rilevamento per Coomassie blue colorazione. </li></ol></li><li> Ulteriori Gel Metodi di analisi <ol><li> Per rilevare la proteina mediante Western blotting, risolvere il complesso da SDS o PAGE nativo e quindi sondare il gel per l&#39;epitopo Calmodulina Binding Peptide (CBP) utilizzando un anticorpo tag TAP secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzando un colorante fluorescente specifico (s), confermare la presenza e l&#39;integrità delle proteine ​​e / o acido nucleico in un complesso di rubinetto depurata. Fare attenzione che non viene rilevato alcun sovrapposizione spettrale tra queste macchie. </li></ol></li><li> Negativo visualizzazione Stain Electron Microscopy <ol><li> Utilizzare le griglie di carbonio continue glow-scaricata a -15 mA per 30 secondi, in 30 minuti di applicazione complessa. </li><li> Applicare 3 ml di TAP purificato complesso (tipicamente ad una concentrazione di 1 nM) alla griglia. Incubare per un minuto. blot fROM lato della griglia per rimuovere l&#39;eccesso di buffer. </li><li> Lavare due volte con 20 gocce microlitri di acqua deionizzata. macchia laterale tra un lavaggio. </li><li> Applicare griglia per un 50 microlitri negativo goccia macchia e incubare per un min. Si raccomanda di colorazione con acetato di uranile (2%) o uranile formiato (0,75%). Attenzione: sali e soluzioni di uranile sono debolmente radioattivo e contengono metalli pesanti. Questi dovrebbero essere maneggiati con cura e tutto il materiale che entra in contatto con queste soluzioni devono essere smaltiti secondo le linee guida consigliate rifiuti istituzionali. </li><li> Applicare griglia per un fresco 50 ml goccia macchia negative, senza assorbente. Incubare per un minuto, poi il lato macchia, e infine asciugare all&#39;aria e visualizzare. </li></ol></li><li> Cryo Microscopia Elettronica (crio-EM) Visualizzazione <ol><li> Eseguire crio-EM con TAP purificato complesso, anche se l&#39;ottimizzazione può essere necessario, secondo il protocollo del produttore. Nota: Presenza di detersivo a concentrazioni alte may impedire il progresso e è discusso qui di seguito. </li></ol></li></ol> 5. stoccaggio Complex <ol><li> Preparazione complesso per bagagli <ol><li> Concentrare il complesso, se necessario, utilizzando un filtro centrifugo avente un peso molecolare di cut-off appropriato per il complesso. Spin a 14000 g per incrementi di 1 min fino a raggiungere la concentrazione desiderata. Nota: concentrazione NP-40 aumenterà in concentrazione durante concentrazione, in quanto non passa attraverso la membrana del filtro nè dialisi. </li><li> Flash congelare il complesso in 30 aliquote microlitri in azoto liquido o ghiaccio secco raffreddato bagno di etanolo e poi conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> La rimozione post-purificazione opzionale di detersivo </li></ol> Nota: La presenza di un detergente tipo NP-40 e ad una concentrazione superiore a quella della sua concentrazione critica micellare può ostacolare o inibire il progresso per alcune applicazioni. Le conseguenze della sua rimozione dal protoCol così come la sostituzione con altri additivi o co-solventi sono discussi di seguito. Se nessun NP-40 è desiderato, una possibilità è quella di utilizzare una applicazione commerciale per la rimozione, ad esempio Bio-perline. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pre-equilibrare disponibili in commercio detergenti assorbire perline in Dialisi buffer. Mescolare cinque perle per 30 ml di complesso (di solito a 10 concentrazioni nM). </li><li> Incubare perline equilibrate dal punto 5.2.1 con TAP complesso purificato per 15 min in ghiaccio. Utilizzare complesso entro poche ore dalla rimozione di detersivo. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il metodo TAP utilizza due tag che bilanciano la necessità di rigorosa e selettiva legame con una resina di affinità con un desiderio di mantenere vicino a condizioni di soluzioni fisiologiche. Questo equilibrio serve a preservare l&#39;interazione stabile (s) della proteina tag con l&#39;interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Inoltre, TAP individuo etichettato ORF sono disponibili da una fonte commerciale, in modo che si può ottenere qualsiasi ceppo di lievito con una proteina codif...

Molti importanti processi cellulari sono svolte da grande proteina e proteina-RNA complessi 1. Un collo di bottiglia di eseguire studi biofisici e strutturali tali complessi loro è ottenere una adeguata qualità (cioè, l&#39;omogeneità) e ad una idonea concentrazione. Isolare un complesso da una fonte nativa ha molti vantaggi, tra cui trattenere rilevanti modificazioni post-trascrizionali e / o traslazione di subunità e assicurare il corretto assemblaggio complesso. Tuttavia, grandi complessi cellulari sono spesso presenti in una cellula ad un basso numero di copia e la purificazione devono essere altamente efficiente e verificarsi in condizioni fisiologiche vicino per assicurare l&#39;integrità complesso è mantenuta. Purificare un complesso da una fonte eucariotica è particolarmente impegnativo e può essere finanziariamente proibitivo. Così, le strategie o metodi che siano efficienti e producono un complesso omogeneo sono altamente desiderata. Una strategia che è statasuccesso nel purificare complessi nativi di cellule eucariotiche per la loro caratterizzazione iniziale è il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) 2,3. Il metodo TAP è stato inizialmente concepito per purificare una proteina nativa dal lievito in erba (S. cerevisiae) in complesso con l&#39;interazione fattore (s) 2. Il metodo utilizzato TAP due tag, ogni tag fusa in tandem per la stessa sequenza del gene della proteina-codifica. I tag sono stati selezionati in modo da bilanciare la necessità di rigorosa e selettiva legame una resina di affinità con un desiderio di mantenere condizioni quasi soluzione fisiologica. Questo equilibrio serve a preservare l&#39;interazione stabile (s) della proteina tag con l&#39;interazione dei fattori (s) per la caratterizzazione post-purificazione. Il tag TAP genomicamente incorporata è stata posta alla fine (C-terminale) di un gene codificante e consisteva di una sequenza codificante per un Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguita da Protein A - un&#39;aggiunta di poco più di 20 kDa la targhetta proteina. CBP è breve, 26 amminoacidi, e riconosciuti dal ~ 17 kDa proteina calmodulina (CaM) in presenza di calcio con una K D dell&#39;ordine di 10 -9 M 4. Il tag Proteina A è maggiore, costituito da due ripetizioni di 58 residui con una breve linker tra le ripetizioni. Ogni ripetizione acid 58 amino è riconosciuto da immunoglobulina G (IgG) con K D ~ 10 -8 M 5. Tra questi due tag è stato incorporato un sito di riconoscimento per il TEV proteasi, un endopeptidasi dal virus Tobacco Etch 6,7. Come illustrato in figura 1, nella prima fase affinità del metodo TAP etichettato proteina è fissata su una resina IgG tramite la proteina A. La proteina marcata è eluito su colonna di scissione dopo l&#39;aggiunta del TEV proteasi, sito-specifica tra cleaving i due tag. Questo è un passo necessario come l&#39;interazione di IgG e proteina A è molto forte e solo può essere adeguatamente perturbata in condizioni denaturanti soluzione. In mancanza di un Protein Un tag, la proteina si lega alla resina CaM in presenza di calcio e eluita da questa resina con aggiunta di EGTA ione metallico chelante (acido tetraacetico etilenglicole) (Figura 1). Subito dopo l&#39;introduzione del metodo TAP, è stato utilizzato in uno studio su larga scala per generare un &#39;map&#39; di interazioni complesse S. cerevisiae 8. È importante sottolineare che, come conseguenza di questo sforzo un intero telaio di lievito-TAP Tagged Open Reading (ORF) biblioteca, così come TAP individuo etichettato ORF 9 sono disponibili da una fonte commerciale. Così, si può ottenere un ceppo di lievito con una proteina codificata per qualsiasi complesso lievito. Il metodo TAP anche stimolato modifiche o varianti del tag TAP, tra cui: il suo utilizzo per la purificazione di complessi provenienti da altri eucariotica così come le cellule batteriche 10,11; la progettazione di un &quot;tag raggruppati&quot;, in cui la proteina A e CBP sono posti su differenti proteine ​​12; e la tags cambiato, in modo da accogliere la necessità del ricercatore, come la sensibilità del complesso Ca 2+ o EGTA 13. I recenti progressi sia in strumentazione e metodologie hanno portato a progressi significativi nell&#39;applicazione di microscopia elettronica (EM) per la determinazione della struttura, che hanno portato in alto, nei pressi di immagini atomiche risoluzione di complessi macromolecolari 14. La risoluzione ottenibile di un complesso di EM, tuttavia, resta subordinata alla qualità del complesso in esame. Questo studio ha utilizzato l&#39;approccio tag TAP per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un 18-subunità (~ 0,8 MDA) a basso numero di copie complesso ribonucleoproteico che fa parte del spliceosome 15,16. Un certo numero di passi sono stati compiuti per purificare questo complesso tale che è omogenea e di una concentrazione adeguata. Potenziali problemi riscontrati nelle varie fasi della purificazione sono descritti e strategie adottate per superare challEnges evidenziati. Valutando con attenzione e ottimizzando passi nella purificazione, l&#39;U1 snRNP purificato è di una qualità e ad un quantitativo adatto per macchia negativa e (crio-EM) studi di elettroni crio microscopia. Un metodo ottimizzato protocollo TAP per la purificazione di complessi native per studi strutturali è descritta nel presente documento.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP tagged strain</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Coffee grinder</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Used for cell lysis</td></tr><tr><td>Hemocytometer, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Used to assess cell lysis</td></tr><tr><td>JA 9.100 centrifuge rotor&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to harvest the yeast cells</td></tr><tr><td>JA 20 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material</td></tr><tr><td>Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Used to further clear the soluble cell extract</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Temperature controlled shaker</td></tr><tr><td>Novex gel system</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>Calmodulin resin</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Affinity resin</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, mini tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail, large tablets</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free tablets</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>Used to pack and wash the Calmodulin resin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Used to pack and wash the IgG resin</td></tr><tr><td>Precast native PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>NativeMark protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 &amp;mu;l for a silver stained gel and 5 &amp;mu;l for a SYPRO Ruby stained gel</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Unstained protein standard used for Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Primary antibody against CBP tag</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis units</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td></tr><tr><td>Detergent absorbing beads</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm</td></tr><tr><td>Copper grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of native complexes for structural study using a tandem affinity tag method

approcci purificazione per affinità sono riusciti ad isolare complessi native per la caratterizzazione proteomica. eterogeneità strutturale e un grado di eterogeneità composizionale di un complesso di solito non impediscono progressi nel condurre tali studi. Al contrario, un complesso destinato caratterizzazione strutturale deve essere purificato in uno stato che è sia per composizione e strutturalmente omogeneo, nonché ad una maggiore concentrazione di quanto richiesto per proteomica. Recentemente, ci sono stati progressi significativi nell&#39;applicazione di microscopia elettronica per la determinazione della struttura di grandi complessi macromolecolari. Questo ha accresciuto interesse per approcci per purificare complessi nativi di qualità sufficiente e quantità per la determinazione strutturale di microscopia elettronica. Il metodo Tandem Affinity Purification (TAP) è stato ottimizzato per estrarre e purificare un 18-subunità, ~ 0.8 MDa assemblaggio ribonucleoproteico dal lievito in erba (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adatto a macchia negativa e crioconservati microscopia elettronica. In questo è dettagliato le modifiche apportate al metodo TAP, il razionale per fare questi cambiamenti, e gli approcci adottati per test per un complesso compositivo e strutturalmente omogeneo.

Un metodo TAP modificata è stata usata per purificare da S. cerevisiae U1 snRNP, un complesso ribonucleoproteina 18 subunità. Una purificazione TAP iniziale del complesso seguendo il 2,3 protocollo pubblicato ha prodotto un complesso che è apparso eterogenea, la migrazione di tre bande su un argento macchiate gel di poliacrilammide nativo (Figura 2A). Molteplici cicli di ottimizzazione del metodo TAP, ha prodotto un complesso che migrato principalm...

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Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  Brandeis University. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies. 

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

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Biochimica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ottimizzazione dell'FPLC per una purificazione efficiente della proteina FEN1 marcata con His.

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. The Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system allows high-resolution separation of complex protein mixtures. By adjusting various parameters in FPLC, such as selecting the appropriate purification matrix, regulating the protein sample's temperature, and managing the sample's flow rate onto the matrix and the elution rate, it is possible to ensure the protein's stability and functionality. In this protocol, we will demonstrate the versatility of the FPLC system to purify 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1) protein, produced in bacterial cultures. To improve protein purification efficiency, we will focus on multiple considerations, including proper column packing and preparation, sample injection using a sample loop, flow rate of sample application to the column, and sample elution parameters. Finally, the chromatogram will be analyzed to identify fractions containing high yields of protein and considerations for proper recombinant protein long-term storage. Optimizing protein purification methods is crucial for improving the precision and reliability of protein analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottimizzazione della cromatografia di affinità per la proteina FEN1 marcata con His.

This article provides a procedure for the affinity purification of a human recombinant protein, flap endonuclease 1 (FEN1), which has been labeled with a 6X-histidine tag. The protocol involves the utilization of two distinct immobilized metal ion columns for the purification of the tagged protein.

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Biologia

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

Riepilogo

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Proteine Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine correlazione Profiling

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Identificazione di complessi proteici in

Purificazione di Native Complessi di studio strutturale utilizzando un metodo Tag Tandem Affinity

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