Name: a high-content in vitro pancreatic islet β-cell replication discovery platform
Uploaded: 2016-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
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This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).

Este protocolo foi realizado em conformidade com o Comité Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Stanford University School of Medicine. O protocolo descrito é dimensionado para isolamento de ilhotas de seis 250-300 g (8 - 9 semanas de idade) ratos Sprague Dawley do sexo masculino, a qual é suficiente para gerar 228 poços de uma placa de 384 poços para análise da replicação de células dos ilhéus. 1. Preparação de Material <ol><li> Preparar composições de revestimento antes de se iniciar o isolamento dos ilhéus através da recolha do meio condicionado de células de carcinoma da bexiga de rato 804G mantida a confluência durante 3 dias (20 ml de RPMI 1640) em 15 cm de placa de cultura de tecido 28. Filtrar em condições estéreis e armazenar (-20 ° C) o meio condicionado para uma utilização posterior. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos (um 12 cm pinça dentada, um 11,5 cm tesoura fina, um 14,5 cm tesouras cirúrgicas, duas de 16 cm pinça curva, um de 12 cm hemostática curva, um de 12 cm bisturi punho) e um 30 peneira de malha de tecido antes para o initiating isolamento de ilhotas. </li><li> Preparar a solução de digestão pancreática através da dissolução de 60%: mistura de 40% de classe I purificado: classe colagenases II (actividade total de colagenase de 300.000 - 400.000 unidades) em 60 ml de 1x Hank Equilibrada de Salt Solution (HBSS) suplementada com cálcio e magnésio. Carregar 10 ml de tampão de digestão pancreática em 10 ml seringas (seis) com uma agulha G 1 &quot;22 e colocar em gelo. Nota: 10 ml de solução de digestão é injectado por rato. Escala em conformidade. </li><li> Prepare a 4,5 ml de mistura de anestésico em uma capa ventilado através da mistura de 1,3 ml de cetamina (100 mg / ml), 0,2 ml de xilazina (100 mg / ml) e 3 ml de PBS. Prepara-se o cocktail de anestésico dentro de 1 hora de início isolamento de ilhotas. </li><li> Preparar o tampão de lavagem através da adição de 25 ml de soro de vitelo recém-nascido a 500 ml de HBSS. Coloque tampão de lavagem em gelo para uso posterior. </li><li> Prepare uma garrafa de meio ilhéu que fica a 500 ml de baixa glucose de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Prepare forma função das ilhotas de solução de funcionalidade / viabilidade (500 ml) com 2% de FBS, glutamina 2 mM, glucose a 5 mM, 5000 unidades / ml de penicilina e 5000 ug / ml de estreptomicina. Armazenar a função de meios de ilhotas (4 ° C) para uso posterior. </li><li> Preparar 40 ml de tampão de bloqueio por adição de 2,5 ml de soro de burro e 0,12 ml de Triton X-100-37,38 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS). Loja tampão de bloqueio (4 ° C) para uso posterior. </li><li> Obter os anticorpos necessários antes de iniciar o protocolo. Nota: PDX-1 (TRITC) e Ki-67 (FITC), o co-coloração é utilizado para rastreio a replicação de células β primária. Para a análise de replicação de linhagem específica, executar coloração por imunofluorescência de marcadores adicionais identidade da célula (insulina, glucagon, somatostatina; vimentina ou TRITC), juntamente com nuclear (DAPI), Ki-67 (FITC) coloração PDX (Cy5) e. rep alternativacação, por exemplo, marcadores, PCNA, também pode ser usado. </li><li> Prepare um plano de tratamento 228 poços com cada condição de tratamento realizado em quadruplicado. Incluir (5-Iodotubercidin [1? M] ou o dipiridamol [15 mM]) e do veículo de controle-positiva (DMSO 1: 666 de diluição) poços. </li></ol> 2. Perfusão do Pâncreas <ol><li> Anestesiar ratos por injecção IP de solução anestésica de cocktail diluído (0,30 ml / 100 g de peso corporal). Uma vez que o rato é totalmente anestesiado e que não respondem a estímulos nocivos, execute deslocamento cervical. </li><li> Coloque o rato sacrificados na posição (orientação crânio-caudal) em decúbito dorsal em uma pilha de papel toalha e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol. </li><li> Abrir a cavidade abdominal com um L-incisão (base na região púbica) e retrair a pele no sentido rostral sobre a caixa para expor a cavidade abdominal. </li><li> Cuidadosamente pegar o duodeno usando dois pares de pinças curvas, localize a entrada duodenal do b comumduto ile (esfíncter de Oddi) e fixe a abertura duodenal na papila com uma pinça hemostática curva. </li><li> Levante a pinça hemostática curva utilizado para fixar o ducto biliar comum papila e agarrar o ducto biliar perto de fígado usando um fórceps curvos. Use dissecção romba com as pinças curvas para isolar e expor o canal biliar. </li><li> Reposicionar o rato com o proximal cabeça e os pés distal. </li><li> Canular o ducto biliar comum (CBD) em ou imediatamente distai à junção dos ductos hepáticos císticos e comuns com uma solução de digestão pancreática -loaded seringa de 10 ml e injectar lentamente 10 ml da solução de digestão pancreática. Enquanto está a injectar, apoiar o CBD com um cabo de bisturi. Reposicionar a agulha se o duto e pâncreas não insuflar. </li><li> Remover o pâncreas inflados usando as pinças curvas e tesouras finas para separá-lo do cólon descendente, intestinos, estômago e baço. Coloque o pâncreas infladas de gelo em um tubo de 50 ml contendo 5 ml de <em&gt; solução de digestão pancreática. Nota: Para um rendimento máximo ilhéu, recolher todas pancreata dentro de 30 min e local apenas 1 ou 2 pancreata em cada tubo de 50 ml digestão. </li></ol> 3. A dissociação do Pâncreas <ol><li> Uma vez que todos os pâncreas são recolhidos, colocar os tubos de digestão em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Agite suavemente os tubos a cada 3 min. </li><li> Após 15 min, agite (verticalmente) os tubos de 10 vezes e adicione 10 ml de tampão de lavagem frio. Agitar vigorosamente os tubos de um adicional de 5 vezes e colocar no gelo. </li><li> Encher os tubos de digestão a 50 ml com tampão de lavagem frio e misture invertendo os tubos 5 vezes. </li><li> Centrifugar os tubos a 97 xg, a 4 ° C durante 1 min e deitar fora o sobrenadante. Tenha cuidado para não deslocar o tecido peletizada. </li><li> Adicionar 25 ml de tampão de lavagem e re-suspender o tecido em vortex suavemente. Repita os passos 3.4 e 3.5 vezes mais. </li><li> Coloque uma peneira de malha de tecido 30 ao longo de um rerile 250 ml copo e despeje a suspensão de tecido para a peneira. Lavar o tubo de digestão com um adicional de 20 ml de tampão de lavagem e verter sobre a malha. Os tecidos pancreáticos e gordura não digerida são removidos nesta etapa. </li><li> Verter o material filtrado em dois tubos de 50 ml fresco e peletizar o tecido por centrifugação a 97 xg durante 1 min a 4 ° C. Decantar tubos de sobrenadante e inverter para drenar o excesso de buffer. </li></ol> 4. Purificação de Ilhotas <ol><li> Adicionar 20 ml de solução de diatrizoato frio polissacarose / de sódio (1,119 g / ml de densidade) para o tecido pancreático sedimentadas. Homogeneamente re-suspender o conteúdo de cada tubo por suavemente pipetando para cima e para baixo cinco vezes. </li><li> Delicadamente sobrepor a solução diatrizoato polissacarose / sódio com 10 ml HBSS. Manter uma interface líquido afiado adicionando lentamente o HBSS ao longo da parede do tubo. </li><li> Centrifuga-se o pâncreas digerido a 560 xg durante 15 minutos (4 ° C), com aceleração lenta e sem travão. </li><li> collect a camada de ilhotas a partir da interface usando um 10 ml de pipeta e colocar ilhotas no frescos tubos de 50 ml. Não piscina ilhotas nesta fase. </li><li> Adicionar 40 ml de tampão de lavagem a cada tubo de 50 ml e centrifugação durante 1 min a 140 xg, a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e re-suspensão ilhéus reunidas em 50 ml de tampão de lavagem por inversão dos tubos diversas vezes. Centrifugar os tubos durante 1 min a 97 xg, a 4 ° C para recolher ilhotas numa pelete. </li><li> Decantar a solução de lavagem e repetir a lavagem. Traga ilhotas dentro do capuz de cultura de tecidos e aspirar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender cada tubo de ilhotas em 6 ml de meio de ilhotas. </li><li> Transferir os ilhéus de cada tubo de 50 ml num poço de seis poços prato de cultura de tecidos. Agitar o prato de 6 poços para recolher as ilhotas para o meio do poço e observar a qualidade e pureza dos ilhéus sob um microscópio. </li><li> coletar manualmente ilhotas usando uma pipeta de 1 mL e transferir as ilhotas colhidas no adjacentepoços contendo 6 ml de meio de ilhéus. Repita roda ilhéu e pegar até&gt; 90% de pureza é alcançada. </li><li> Transferir os ilhéus purificados para um prato de cultura de tecidos de 10 cm, que inclua 20 ml de meio de ilhota. </li><li> Coloque ilhotas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2) durante a noite (Figura 1A). </li><li> Na preparação de placas em células de ilhéus, revestem-se as cavidades de uma placa de 384 poços com 40 ul de meio condicionado por poço 804G. Incubar durante a noite numa incubadora de cultura de tecidos. </li></ol> 5. Dispersão e chapeamento de células das ilhotas <ol><li> No dia seguinte, separar ilhéus gentilmente o prato de 10 centímetros com um raspador de células e transferir as ilhotas dentro de um tubo de 50 ml. </li><li> Agregar as ilhotas por centrifugação durante 1 min a 22 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Lavar as ilhotas com 20 ml de PBS quente e decanta-se como acima. </li><li> Re-suspender as ilhotas em 0,25% de tripsina (150 ul por pâncreas de rato) E incubar a 37 ° C durante 10 min. Pipeta ilhotas cima e para baixo 10 vezes com 1 ml de pipeta após 5 e 10 minutos de incubação. </li><li> Após 10 min, avaliar uma amostra de 20 ul dos ilhéus tratadas com tripsina sob o microscópio para assegurar uma digestão completa e a contagem das células das ilhotas utilizando um hemocitómetro. Se ilhotas não digeridos permanecem, continuar a incubação durante um adicional de 3-5 min e pipeta cima e para baixo 10 vezes mais. Repita conforme necessário. Nota: O rendimento típico é ~ 125.000 - 150.000 ilhotas células por rato. </li><li> Remover 804G condicionado placa de 384 poços revestidos de mídia da incubadora e remover mídia usando um aspirador de 12 poços múltiplos. </li><li> Suspender as células dos ilhéus, a uma densidade de 45.000 células por ml em meio de função Islet e placa 70 uL (3.150 células) por poço com uma pipeta de canais múltiplos (Figura 1B). Nota: Porque células p localizados nos poços exteriores tendem a migrar em direcção ao perímetro da placa de uso linhas C a N e 4 colunasa 21 para a chapa 228 poços com as células de ilhéus isolados a partir de 6 ratos. </li><li> Colocar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante 48 horas para permitir a aderência celular. </li></ol> 6. Cultura de células das ilhotas Tratamento, fixação e coloração <ol><li> Preparar 200 ul de veículo e compostos (condições de tratamento são realizadas em quadruplicado) a uma concentração de 2x em meio de função Islet. Providenciar compostos em uma placa de 96 poços estéreis para facilitar a pipetagem multi-poços. </li><li> Cuidadosamente remover a forma de ilhotas com um aspirador de 12 poços colector e substitua com meio função das ilhotas (35 ul / cavidade) utilizando uma pipeta de 12 poços. Remover e substituir a mídia de uma linha de cada vez para limitar o risco de secagem (Figura 1C). </li><li> Iniciar o tratamento através da transferência de 35 uL / ​​poço das soluções de composto de 2x. Retorno placa na incubadora durante a duração do tratamento de 48 h. </li><li> Após 48 horas de tratamento, decanta-se o meio de tratamento por invertendo a placa. &lt;/ Li&gt; <li> Lavar suavemente as células das ilhotas com 50 ul por poço de PBS 1x (1 min). Adicionar o PBS utilizando uma pipeta multi-canal. </li><li> Decanta-se o PBS e fixar as células por adição de 50 uL por poço de frio 4% de paraformaldeído (PFA) diluído em PBS 1x. Incubar as células durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as células três vezes (5 min cada), invertendo a placa para remover o PFA e suavemente adicionando 60 ul de PBS por poço, como anteriormente. </li><li> Preparar a solução de recuperação de 15 ml de antigénio por mistura de 14,25 ml de formamida e 0,75 ml de 0,15 M de citrato de sódio (pH 6). Faça a solução de recuperação antigênica imediatamente antes da utilização. </li><li> Remover PBS das cavidades invertendo a placa e adicionar solução de recuperação de antigénio de 60 ul a cada poço. Aquece-se a placa em 70 ° C banho-maria durante 45 min. Coloque um bloco de aquecimento em cima da placa durante esta incubação para evitar a deformação da placa multi-poços. Nota: A água deve ser a metade do caminho até a saia placa; a chapa não deve ser submerso. </li><li&gt; Retirar a placa banho-maria e deixe esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente. Certifique-se de que a placa não está deformado por inspeção visual. </li><li> Lavam-se as células com 60 ul por poço de PBS 1x três vezes (5 min cada). Adicionar PBS com uma pipeta multi-canal e decantar PBS invertendo a placa. </li><li> Usar uma pipeta de multi-canal para adicionar 40 ul por poço de tampão de bloqueamento e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Remover o tampão de bloqueio por inversão da placa e decantação. </li><li> Adicionar 40 ul de ratinho anti-humano Ki-67 (1: 200) e anticorpo de cabra anti-humano PDX-1 (1: 100) anticorpos diluídos em tampão de bloqueio a cada poço e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, decanta-se a solução de anti-corpo e lavar as células com PBS 1x três vezes (5 min cada), tal como descrito acima. Decantar o PBS. </li><li> Adicionar 40 ul por poço de diluído: IgG anti-rato (1 200) de burro biotinilada e IgG anti-cabra de burro conjugado com rodamina em tampão de bloqueio. Incubar durante 1 horaà temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as células com PBS 1x três vezes, 5 minutos cada. Adicionar 40 ul de diluído (1: 400 em tampão de bloqueio) estreptavidina-fluoresceína conjugado a cada poço. Incubar 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as células com PBS 1x três vezes, 5 minutos cada. Adicionar 40 ul por poço de DAPI (300 nM em tampão de bloqueio) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com PBS 1x duas vezes e deixam as células em 40 ul de PBS 1x. A placa é agora pronto para ser analisado. </li></ol> Análise Replication 7. β-Cell Nota: Um protocolo de ensaio deve ser estabelecida para o alto microscópio triagem de conteúdo usado para medir a replicação de células-β. Na sua composição mais simples, este protocolo é um ensaio de duas cores, onde um marcador de identidade é utilizada para definir culas (PDX-1 + -cells) e um marcador de replicação (Ki-67) é utilizado para definir os eventos de divisão celular. <ol><li> Identificar objectos (P-células), baseada no average intensidade de fluorescência de coloração de PDX-1 (549 nm, filtro) dentro de um círculo aproximada (comprimento: largura &lt;1,6) dentro da área de pixel esperado de um núcleo de célula β (Figura 2A). </li><li> Em seguida, estabelecer as definições para identificar eventos de replicação (Ki-67-de positividade) com base na intensidade média de fluorescência (485 nm) de filtro dentro de PDX-1 + a área (Figura 2B). Nota: Os tempos de exposição deve ser fixado para permitir comparações de intensidade de pixel em toda imagens. os parâmetros do protocolo de ensaio são ajustados de forma que as chamadas máquinas consistentemente excluir coloração, detritos e células agregados não específicos que poderiam afetar adversamente a qualidade dos dados. </li><li> Analisar um mínimo de 500 células beta por poço para maximizar a precisão e limite de variabilidade. Nota: O índice basal de replicação de células β em culturas de ilhotas de ratos está prevista para ser de 0,5 - 3%. Tipicamente, 40 imagens por poço é mais do que suficiente para identificar a 500 células p. </li><li> Antes de analisar oToda placa, analisar negativa selecionado (tratados com DMSO) e controle positivo (5-iodotubercidin [1? M] ou o dipiridamol [15 mM]) tenha sido tratada com poços para avaliar a validade do protocolo de ensaio. Quando o ensaio é estabelecida correctamente, compostos de controlo positivo induzir, pelo menos, um aumento de duas vezes na percentagem de culas replicantes. </li><li> Ler a placa inteira uma vez que o protocolo de ensaio é validado. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+kinase+inhibition+selectively+promotes+rodent+and+porcine+islet+beta-cell+replication.">Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+cAMP-modulating+medications+to+promote+beta-cell+replication.">Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication.</a> Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).</li><li>Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+screening+for+secreted+proteins+that+modulate+glucose+handling+identifies+interleukin-6+family+members+as+potent+hypoglycemic+agents.">In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents.</a> PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).</li><li>Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+ornithine+decarboxylase+in+urinary+bladder+carcinoma+cells.">In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells.</a> Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochem J. 310, 997-1003 (1995).</li><li>Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+adult+beta-cells+revealed+using+a+Pdx1/insulin+dual-reporter+lentivirus.">Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus.</a> Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).</li><li>Rieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+hepatocyte+nuclear+factor-4alpha+initiates+cell+cycle+entry,+but+is+not+sufficient+to+promote+beta-cell+expansion+in+human+islets.">Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets.</a> Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus--advances+and+challenges+in+human+beta-cell+proliferation.">Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation.</a> Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

métodos experimentais para estudar as vias moleculares que controlam o crescimento de células β e regeneração são ferramentas importantes para pesquisadores diabetes. Nisto, uma plataforma de rastreio baseado-rato-ilhota para identificar e caracterizar estimuladores de pequenas moléculas de replicação de células β é apresentada. Enquanto a maioria dos aspectos deste protocolo são facilmente realizados por pesquisadores experientes, a poucos passos requerem técnica particular. E...

Diabetes engloba um conjunto de distúrbios que compartilham o ponto final comum de homeostase da glicose interrompido. Embora os mecanismos patogênicos dos subtipos de diabetes são distintos, eles compartilham a conseqüência da massa de células β diminuiu, ou seja, a perda de capacidade de produção de insulina 1,2. Atualmente, as estratégias de tratamento diabetes dependem de administração crônica de insulina exógena, a estimulação farmacológica da produção de insulina ou aumento da sensibilidade à insulina, e, raramente, o transplante de ilhotas pancreáticas ou toda 3,4 pâncreas. Infelizmente, o sucesso dessas estratégias é de curta duração e / ou falha de recapitular suficientemente a função da produção endógena de insulina. Apesar da utilidade de desenvolver um método para estimular a regeneração de células β, não existe tal abordagem. Por conseguinte, um dos principais objetivos diabetes pesquisa é desenvolver métodos para gerar novas células beta ou para expandir a massa de células β endógena 5 </sup&gt;. Embora a regeneração de células-β a partir de fontes renováveis, tais como as células estaminais embrionárias está avançando, segurança e eficiência preocupações fazer a busca de estratégias alternativas, incluindo a expansão das células beta maduras, uma prioridade 6,7. Importante, a fonte predominante de células beta novas in vivo é pré-existentes células beta, em vez de células progenitoras especializados 8,9. Embora células beta parecem ter capacidade limitada de replicação, um pequeno aumento na quantidade de células β (~ 30%) pode ser suficiente para restaurar a homeostase de glucose em muitos diabéticos. Além disso, na estimulação farmacológica in situ da massa de células β é uma estratégia de tratamento potencialmente barato e escalável. Aqui um método de rastreio de alto conteúdo para identificação e caracterização de moléculas pequenas que estimulam o crescimento de células β é apresentada. Uma variedade de métodos experimentais in vitro pode ser utilizado para identificar produtos de genes e / ou moléculas de that promover a replicação de células-β primário. Os esforços iniciais para medir a indução da replicação em células β usado cultura roedor pancreata fetal ou intactos culturas isolado das ilhotas para medir a [3 H] timidina, a incorporação de BrdU ou corpos mitóticos dentro do aldeído-tionina ou insulina população corada em resposta às condições específicas de tratamento 10, 11. Estas abordagens in vitro e variantes próximas da mesma têm várias limitações. Deficiências proeminentes incluem (1) a utilização de células fetais, que, ao contrário de culas maduras, exibem uma elevada taxa de replicação de células basais e são β crescimento regulada de forma distinta 12; (2) a natureza subjetiva da adjudicação dependente do experimentador de eventos de replicação de células-β; (3) o trabalho e tempo natureza intensiva da contagem dependente do experimentador de eventos de replicação de células-β retarda o rendimento experimental; (4) o uso de armas nucleares incorporação / Mancha / aparência para identificar replicação mesmoTS e um corante citoplasmático não sobrepostos para identificar culas leva a misattribution de eventos de replicação de células não-β aproximadas a p-células. Mais recentemente culas maduras primários têm sido usados ​​para avaliar o impacto da sobre-expressão do transgene, bem como o tratamento do produto do gene ou do composto na replicação de células β 13-16. No entanto, estes estudos também têm invocado contagem subjetiva de eventos de replicação, métodos staining- citoplasmática ou não-específicos para a identificação de células β e / ou etapas de trabalho intensivo que limitam o rendimento, por exemplo, cada slide-bem chapeamento de células ou ilhotas intactas inclusão em parafina e processamento 17. Notavelmente, uma célula-β humano metodologia de rastreio replicação baseada em imagem, semelhante ao aqui apresentada, foi publicado em 18 de; No entanto, a utilização bem sucedida deste ensaio não foi demonstrada e a utilização de ilhéus humanos para o rastreio primário pode não ser amplamente feasível. Uma estratégia alternativa para a identificação de substâncias promotoras de replicação é para avaliar a indução do crescimento de linhas de células β. Os esforços iniciais usadas transformadas beta-linhas celulares tais como MIN6 células ou INS 832/13 células-14,19-21. No entanto, estas linhas celulares demonstram crescimento desenfreado e têm pouca semelhança com células beta bem diferenciados 22. Consequentemente, a capacidade de crescimento de indução é mínima, de relevância pouco clara e às vezes difícil de recapitular. Uma estratégia melhorado para o rastreio baseado em linha de célula utiliza &quot;reversivelmente transformada&quot; células que são presos de crescimento na ausência de tetraciclina (doxiciclina) de SV40 dependente de T a expressão de antigénio 23,24. No entanto, não é claro se estas células reverter para um estado de células-β como &quot;normal&quot;, após a remoção de doxiciclina. Infelizmente, o uso dessas células produziu compostos que promovem o crescimento generalizadas que não parecem ter utilidade imediata24. Em geral, a utilização de linhas celulares para estudar a regulação do crescimento de um tipo celular exibindo actividade espontânea replicação mínima pode ter aplicabilidade limitada. A replicação plataforma de triagem de células β aqui apresentada utiliza células p de rato primária maduros para reter na regulação do crescimento in vivo na medida do possível, as culturas de células das ilhotas de composição de tipo celular mista para permitir a identificação de actividades promotoras de crescimento de restrição de linhagem, multi -bem formatação para maximizar o rendimento e análise automatizada para eliminar o preconceito e facilitar a transferência. O sucesso no uso desta plataforma permitiu a identificação de vários compostos que promovem a replicação de células-β 25,26. Além disso, o ensaio foi usado para estudos de relação estrutura-actividade e experiências de epistasia químicos para fornecer informações mecanísticos para a regulação molecular da replicação de células β. A plataforma apresentada foi adaptado com sucesso foinvestigação baseada em RNAi r lentiviral da replicação de células-β vias 25. Limitações do ensaio compreendem uma restrição escalabilidade (uso de pilhas), uso de roedor, em vez de células das ilhotas humanos (embora o ensaio pode ser adaptados para estudos de ilhotas humanas), despesas associadas com a imagem baseada em anticorpos e à utilização de ilhotas primária, a utilização de ilhotas dispersas (interrompido arquitetura da ilhota) para facilitar a aquisição de imagem automatizada e dependência da disponibilidade de um microscópio automatizado, com aquisição de imagem e capacidade de análise. Embora uma fácil in vivo metodologia de rastreio para identificar produtos de genes ou compostos que estimulam a regeneração de células β in situ seria o ideal, uma tal plataforma ainda não está disponível 27. Consequentemente, a plataforma descrito é apropriado para pesquisador interessado em investigar maioria dos aspectos da replicação de células-β.

<table><tbody><tr><td>250 g male Male Sprague Dawly Rat</td><td>Charles River</td><td>Stain # 400</td><td></td></tr><tr><td>12 cm teeth tisuue forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>14.5 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>16 cm curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-16</td><td></td></tr><tr><td>12 cm curved hepostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>12 cm scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tissue sieve-30 mesh</td><td>Bellco Glass</td><td>1985-85000</td><td></td></tr><tr><td>Cizyme RI, 375,000 CDA units</td><td>VitaCyte</td><td>005-1030</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl (200 mg/20 ml)</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>NDC# 42023-113-10</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine (5 g/50 ml)</td><td>LLOYD</td><td>NADA# 139-236</td><td>to make anesthetic cocktail&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>H-1077</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>H-1119</td><td>to make histopaque 1100</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum 500 ml</td><td>Hyclone</td><td>SH30118.03</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30268.01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium/Low Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>Functionality/Viability Solution&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>99-768-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 media&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>804G rat bladder carcinoma cell-line</td><td>Available upon request</td><td></td><td>to make conditioned medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td><td>Gibco</td><td>26160</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Formamide 500 ml</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td>to make 0.15 M Sodium Sitrate solution</td></tr><tr><td>Dextrose, Anhydrous</td><td>EMD Chemicals</td><td>DX0145-1</td><td>to make 1 M glucose solution</td></tr><tr><td>Nomal Donkey Serum (Powder)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Ki67 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human PDX-1 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2419</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody</td><td>Dako</td><td>2016-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody</td><td>Dako</td><td>2014-06</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody</td><td>Dako</td><td>2011-08</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal chicken anti-vimentin antibody</td><td>abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-150</td><td></td></tr><tr><td>StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-025-147</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-025-148</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-175-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Reagent Reservoir 25 ml</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39900</td><td></td></tr><tr><td>384 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>BD Falcon</td><td>353962</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black/clear, tissue culture treated plate</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettor</td><td>Costar</td><td>4880</td><td></td></tr><tr><td>12-channel vaccume aspirator</td><td>Drummond</td><td>3-000-096</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Water Bath Model 2223&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-content screening instrument: ArrayScan VTI</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a high-content in vitro pancreatic islet &#946;-cell replication discovery platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

Para avaliar-célula β ou replicação de células α, um protocolo de ensaio de quatro cores é necessária. Em primeiro lugar, os objectos são identificados por coloração com DAPI (Canal 1, 386 nm). Em seguida, células beta (evento 1) são contadas: objetos que co-expressam PDX-1 + (canal 2, 650 nm) e insulina peri-nuclear (canal 3, 549 nm). Subsequentemente, replicando células beta (Evento 2) são contados: (Evento 1) que co-expressam o Ki-67 (canal 4, 485 nm) <strong...

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A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

11.1K visualizações.  Stanford University School of Medicine.  desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada. 

Vídeo: A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Biologia do Desenvolvimento

Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, respectively. Functional beta cell mass is determined by the anatomical beta cell mass as well as the ability of the beta cells to respond to a nutrient load. A loss of functional beta cell mass is central to both major forms of diabetes 1-3. Whereas the declining functional beta cell mass results from an autoimmune attack in type 1 diabetes, in type 2 diabetes, this decrement develops from both an inability of beta cells to secrete insulin appropriately and the destruction of beta cells from a cadre of mechanisms. Thus, efforts to restore functional beta cell mass are paramount to the better treatment of and potential cures for diabetes.
Efforts are underway to identify molecular pathways that can be exploited to stimulate the replication and enhance the function of beta cells. Ideally, therapeutic targets would improve both beta cell growth and function. Perhaps more important though is to identify whether a strategy that stimulates beta cell growth comes at the cost of impairing beta cell function (such as with some oncogenes) and vice versa.
By systematically suppressing or overexpressing the expression of target genes in isolated rat islets, one can identify potential therapeutic targets for increasing functional beta cell mass 4-6. Adenoviral vectors can be employed to efficiently overexpress or knockdown proteins in isolated rat islets 4,7-15. Here, we present a method to manipulate gene expression utilizing adenoviral transduction and assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets (Figure 1). This method has been used previously to identify novel targets that modulate beta cell replication or function 5,6,8,9,16,17.

This protocol allows one to identify factors that modulate functional beta cell mass to find potential therapeutic targets for the treatment of diabetes. The protocol consists of a streamlined method to assess islet replication and beta cell function in isolated rat islets following manipulation of gene expression with adenoviruses.

Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

Glucose homeostasis is primarily controlled by the endocrine hormones insulin and glucagon, secreted from the pancreatic beta and alpha cells, ...

Medicina

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

Análise de co-cultura da Relação de proteínas extracelulares que afetam secreção de insulina por células beta pancreáticas se

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Bioengenharia

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Eventos de sinalização intracelular e secreção hormonal em pseudoilhotas humanas

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autor em destaque: Investigando anormalidades e função de ilhotas com um protocolo de pseudoilhotas 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

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