This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelos Institutos Nacionais de Saúde e sob um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal no Scripps Research Institute. 1. Lens Dissection <ol><li> Euthanize camundongos acordo com as recomendações dos Institutos Nacionais de Saúde &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório&quot; e protocolos de uso instituição animais aprovados. </li><li> Enuclear o olho de ratos usando uma pinça curva. Deprimir o tecido em volta do olho com a pinça para trazer o olho para fora da tomada, e depois arrancar o olho do soquete com a pinça. Transferir os olhos ao fosfato 1x salina fresca tamponada (PBS) no prato de dissecação. </li><li> Cortar o nervo óptico tão perto do globo ocular possível. Suavemente e com cuidado insira uma pinça reta finos no globo ocular através do wher buracoe o nervo óptico sai do posterior. </li><li> Cuidadosamente fazer uma incisão com tesoura no globo ocular a partir do posterior para o bordo da córnea. lentes de roedores ~ ocupar 30% do olho. Faça essas incisões cuidadosamente, e não introduza pinças ou tesouras muito profundo no olho para evitar danificar a lente. </li><li> O corte ao longo da junção entre a córnea e a esclera, pelo menos, a meio caminho em torno do globo ocular. </li><li> Com cuidado, empurre sobre a córnea para remover a lente do olho, através da abertura feita nas etapas 1.4 e 1.5. </li><li> Use uma pinça ponta reta finos para remover cuidadosamente qualquer grande detritos que ainda está ligado à lente. inspecionar visualmente a lente por qualquer dano antes de prosseguir com as medidas de rigidez. </li></ol> 2. Medidas de rigidez <ol><li> Pesar pelo menos 10 lamelas a partir da mesma caixa usando uma balança analítica. Encontre o peso médio das lamelas. Para consistência, use a mesma caixa de lamelas para todos os experimentos. Pré-molhadoAs lamelas e em ângulo recto espelho em 1x PBS à temperatura ambiente durante pelo menos duas horas antes de começar as experiências. </li><li> Encha a câmara de medição (ver Figura 1) com 65 - 75 ml de 1x PBS. A câmara de medição foi feita de Plexiglas por uma loja de máquina em casa, e divots na câmara foram feitas por uma imprensa de broca ajustado para a profundidade desejada com uma broca apropriada. Lentes permanecer transparente em 1x PBS, à temperatura ambiente, durante a duração do teste mecânico. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> Figura 1:. Rigidez Medição Secção Uma foto que mostra as dimensões da câmara de medição de rigidez feito por medida com uma variedade de torrões de diferentes profundidades e formas. Os divots redondas que são 200 mm ou 300 mm de profundidade (setas amarelas) são utilizados para as medições em lentes de rato. Divots são 2 mm de diâmetro e 13 ~-. 14 mm a partir da borda da câmara <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> Coloque espelho de ângulo direito para dentro da câmara a uma distância constante do torrão que vai ser usada para segurar a lente. Certifique-se o espelho não se move durante o experimento. </li><li> Transferência de lentes dissecados a câmara de medição com cuidado com apreensão fórceps ou pinças curvas. </li><li> Dê uma vista de cima imagem da lente descarregado directamente de cima. Tome rato fotos lente em 30X de ampliação com iluminação de microscópio de dissecação (inferior) e uma fonte de luz de fibra óptica nas laterais esquerda e direita. Definir a fonte de alimentação da fibra óptica a 80% da intensidade de luz máxima. Ajustar a saída da fonte de alimentação com base na iluminação ambiente, a preferência do usuário e qualidade de imagem, conforme necessário. </li><li> Dê uma vista lateral imagem da lente sem carga, o que pode ser visto através do riespelho GHT-ângulo. Se a câmera não está calibrado, tirar uma foto da borda do espelho no foco. A aresta do espelho é de 5 mm de comprimento, e essa medida pode depois ser usado para determinar a pixels / mm e servir como uma barra de escala nas imagens. </li><li> lente lugar no torrão, e confirme que a lente está sentado de forma segura e em linha reta no torrão. Tire uma foto da lente antes do carregamento. A lente deve estar descansando na torrão sobre o seu anterior ou pólo posterior. </li><li> Coloque uma lamela suavemente sobre a lente. Aguarde 2 min para permitir a fluência, e pegue outro lado-vista de imagem da lente carregado. </li><li> Continue adicionando lamelas como no passo 2.8 e tendo side-ver fotos após a adição de cada lamela como no passo 2.8 até um total de 10 lamelas são aplicadas. </li><li> Remova todas as lamelas. Aguarde 2 min, e dar uma visão lateral imagem da lente (dentro e fora do torrão) após a remoção de todas as lamelas. </li></ol> Medição 3. Lens Nucleus <ol><li> para determine o tamanho núcleo da lente, mover a lente para uma placa de Petri limpa preenchido com 1x PBS. </li><li> Gentilmente decapsulate a lente usando uma pinça reta finos. </li><li> Slough fora das células das fibras corticais por rolando a lente entre os dedos enluvados. O núcleo do cristalino remanescente vai se sentir como um mármore duro. Usar este procedimento para isolar o núcleo em lentes de adultos a partir de 1 mês de idade. Uma vez que o núcleo isolado é um corpo rígido, mais ensaios mecânica do núcleo da lente não pode ser executada utilizando este método descrito. </li><li> Lave o núcleo da lente em 1x PBS numa placa de Petri. </li><li> Coloque o núcleo da lente de volta para a câmara de medição (não no torrão), e tomar uma imagem do núcleo da lente através do espelho de ângulo direito. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> Figura 2:. A Lenses mouse comprimido por Lamelas (A) Esquema e (B) fotografia do exconfiguração perimental mostrando uma lente de 2 meses de idade mouse em um torrão de 200 mm de profundidade na câmara de medição preenchida com 1x PBS. Um espelho ângulo direito e uma câmera digital acoplada a um microscópio de dissecação foram usadas para recolher imagens da lente durante a compressão por lamelas. (C) Fotos de pontos de vista sagital de um 2 meses de idade lente de tipo selvagem comprimido sucessivamente um número crescente de lamelas, desde que os dados brutos para medir diâmetros axiais e equatoriais e calculando tensões axiais e equatoriais durante o teste de compressão à base de lamela. A reflexão da lente pode, por vezes, ser visto nas lamelas (mais claramente visível na imagem uma lamela). Ao fazer medições, ignorar a reflexão e medir até o ápice da lente. (D) Fotos de pontos de vista sagital dos 2 meses de idade, do tipo selvagem lente pós-compressão eo núcleo isolado lente. A lente pós-compressão e núcleo isolado está sentado fora do torrão. Barras de escala, de 1 mm. Este valor é modificado a partir Gokhin, et al. PLoS ONE, 19, 2012. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Análise 4. Imagem <ol><li> Medir diâmetros equatoriais e axiais de lentes antes do carregamento e após cada etapa de carregamento usando ImageJ ou software similar. Medir o diâmetro de cada núcleo da lente. O núcleo da lente é esférica de modo quase uma medição em qualquer orientação será suficiente 19,21. </li><li> Corrigir a lente axial diâmetros adicionando a profundidade do torrão utilizado. Na câmara de medição, o torrão obscurecido 200 uM (lentes de 2 meses de idade) ou de ratinho (300 um lentes de 4 meses de idade e 8 meses de idade) do rato da espessura axial da lente. </li><li> Calcule o axial e estirpes equatoriais a partir das medições do diâmetro da lente usando a equação, ε = (d - d 0) / d 0, onde ε é a tensão, d é a axial ou ediâmetro quatorial a uma determinada carga, e d é o diâmetro 0 axial ou equatorial correspondente a uma carga nula. </li><li> Traça-se a estirpes axial e equatorial como funções da carga aplicada (em mg). </li><li> Traçar a axial, equatorial e diâmetros nucleares. Calcular e traçar a relação de aspecto lente dividindo o diâmetro axial pelo diâmetro equatorial. </li><li> Calcular e definir o volume da lente usando a equação, Volume = 4/3 x π × 2 × R e R a, em que Re é o raio equatorial e R a é o raio medido a partir axial da fotografia tirada no passo 2.6. Esta equação assume a lente é um esferóide oblato (elipsóide) 1,22. </li><li> Calcular e definir o volume nuclear utilizando a equação, Volume = 4/3 x π × R 3 N, em que R N é o raio do núcleo da lente, conforme medido a partir da fotografia tirada no passo 3.5. Esta equação assume que o núcleo da lente iesfera sa 19,21. </li><li> Calcular e representar graficamente a fracção nuclear, tal como a razão do volume nuclear para o volume da lente. </li></ol>

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K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium:+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses.">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li><li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens.">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens.">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth:+I.+Nonprimate+lenses.">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Há várias considerações importantes quando se usa este método para medir a rigidez da lente. Em primeiro lugar, as lamelas são aplicados para a lente com um ângulo ligeiramente oblíquo (8-8,5 °) em relação ao fundo da câmara (θ). Isto aplica-se um componente muito pequeno da carga equatorial ao invés de axial. No entanto, essa carga equatorial é considerado insignificante, porque o pecado θ ≈ 0,1 19. Se este método é adaptado para lentes maiores, o ângulo das lamelas para o fundo da câma...

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table><tbody><tr><td>Fine tip straight forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors, straight edge</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Seizing forceps</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Dissection dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Measurement chamber with divots to hold lenses</td><td></td><td></td><td>Custom-made (see &lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>Right-angle mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>Illuminated dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>With SZ-PT phototube</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

A lente do olho é um órgão transparente que refrata e focaliza a luz para formar uma imagem nítida sobre a retina. Nos seres humanos, os músculos ciliares contrato para deformar a lente, levando a um aumento na potência óptica das lentes para focar objetos próximos, um processo conhecido como acomodação. mudanças relacionadas à idade na rigidez da lente têm sido associados a presbiopia, uma redução na capacidade da lente para acomodar, e, por extensão, a necessidade de óculos de leitura. Mesmo que as lentes do mouse não acomodar ou desenvolver presbiopia, modelos de ratos pode fornecer uma ferramenta genética inestimável para patologias lente compreensão, eo envelhecimento acelerado observado em camundongos permite o estudo de mudanças relacionadas à idade na lente. Este protocolo demonstra um método simples, precisa e de custo eficaz para determinar a rigidez da lente do mouse, utilizando lamelas de vidro para aplicar sequencialmente crescente cargas de compressão na lente. Os dados representativos confirmar que as lentes do mouse se tornar mais rígida com a idade, comolentes humanas. Este método é altamente reprodutível e pode, potencialmente, ser ampliados por meios mecânicos lentes de teste a partir de animais maiores.

A rigidez e dimensões de lentes 2-, 4- e 8 meses de idade rato foram medidos. Os ratinhos foram todos os animais de tipo selvagem sobre um fundo puro estirpe C57BL6 obtido a partir da criação de animais Facilidade TSRI animal, e cada lente foi carregado com 1 a 10 lamelas. As estirpes axiais e equatoriais foram calculadas como uma função da carga aplicada através da medição do diâmetro equatorial e axial da lente após a adição de cada lamela, e depois normalizando a cada muda...

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Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.2K visualizações.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Vídeo: Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging windows is particularly powerful because it allows longitudinal observation of the same tissue over days to weeks. Typical imaging windows comprise a glass coverslip in a biocompatible metal frame sutured to the mouse&#8217;s skin. These windows can interfere with the free movement of the mice, elicit a strong inflammatory response, and fail due to broken glass or torn sutures, any of which may necessitate euthanasia. To address these issues, windows for long-term abdominal organ and mammary gland imaging&#160;were developed from a thin film of polydimethylsiloxane (PDMS), an optically clear silicone polymer previously used for cranial imaging windows. These windows can be glued directly to the tissues, reducing the time needed for insertion. PDMS is flexible, contributing to its durability in mice over time&#8212;up to 35 days have been tested. Longitudinal imaging is imaging of the same tissue region during separate sessions. A stainless-steel grid was embedded within the windows to localize the same region, allowing the visualization of dynamic processes (like mammary gland involution) at the same locations, days apart. This silicone window also allowed monitoring of single disseminated cancer cells developing into micro-metastases over time. The silicone windows used in this study are simpler to insert than metal-framed glass windows and cause limited inflammation of the imaged tissues. Moreover, embedded grids allow for straightforward tracking of the same tissue region in repeated imaging sessions.

An approach is here presented for long-term intravital imaging using optically clear, silicone windows that can be glued directly to the tissue/organ of interest and the skin.&#160;These windows are cheaper and more versatile than others currently used in the field, and the surgical insertion causes limited inflammation and distress to the animals.

Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Pesquisa do câncer

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Síntese de elastômeros de silicone macio-ureia para aplicação de lente intra-ocular

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Química

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved through the contraction of the ciliary body and relaxation of zonule fibers, which results in the thickening of the lens necessary for near vision. Here, we present a novel, simple method in which accommodation is replicated by tensing the zonules connected to the lens capsule via a manual lens stretcher (MLS). This method monitors the radial stretching achieved by a lens when subjected to a consistent force and allows for a comparison of accommodating lenses, which can be stretched, to non-accommodating lenses, which cannot be stretched. Importantly, the stretcher couples to the zonules directly, and not to the sclera of the eye, thus only requiring the lens, zonules, and ciliary body rather than the entire globe sample. This difference can significantly decrease the cost of acquiring donor cadaver lenses by about 62% compared to acquiring an entire globe.

We present an efficient method of studying lens accommodation by using a manual lens stretcher. The protocol mimics physiological accommodation by pulling the zonules connected around the lens capsule, thereby, stretching the lens.

Simulando a mecânica de lente Alojamento através de uma lente Manual esticador

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Bioengenharia

Coloração por imunofluorescência de interdigitações de membrana em células de fibra de lente

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear image. The bulk of this tissue comprises specialized, differentiated fiber cells that have a hexagonal cross section and extend from the anterior to the posterior poles of the lens. These long and skinny cells are tightly opposed to neighboring cells and have complex interdigitations along the length of the cell. The specialized interlocking structures are required for normal biomechanical properties of the lens and have been extensively described using electron microscopy techniques. This protocol demonstrates the first method to preserve and immunostain singular as well as bundles of mouse lens fiber cells to allow the detailed localization of proteins within these complexly shaped cells. The representative data show staining of the peripheral, differentiating, mature, and nuclear fiber cells across all regions of the lens. This method can potentially be used on fiber cells isolated from lenses of other species.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de biomecânica de lentes por meio de um novo protocolo para imagens de interdigitações complexas e coloração de proteínas 

This protocol describes methods to prepare peripheral, mature, and nuclear eye lens fiber cells for immunofluorescence staining to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture.

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Biologia do Desenvolvimento

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Medição da rigidez de substratos de Silicone macio para estudos de Mechanobiology, usando um microscópio de fluorescência Widefield

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Caracterização Biomecânica de Lente Ocular Suína com Compressão Automatizada

Automated Compression Testing of the Ocular Lens

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically with age in the human lens, resulting in a loss of near vision called presbyopia. However, the mechanisms of these changes remain unknown. Lens compression offers a relatively simple method for assessing the lens' biomechanical stiffness in a qualitative sense and, when coupled with appropriate analytical techniques, can help quantify biomechanical properties. A variety of lens compression tests have been performed to date, including both manual and automated, but these methods inconsistently apply key aspects of biomechanical testing such as preconditioning, loading rates, and time between measurements. This paper describes a fully automated lens compression test wherein a motorized stage is synchronized with a camera to capture the force, displacement, and shape of the lens throughout a preprogrammed loading protocol. A characteristic elastic modulus may then be calculated from these data. While demonstrated here using porcine lenses, the approach is appropriate for the compression of lenses of any species.

Autor em destaque: Avançando na compreensão das mudanças de rigidez da lente relacionadas à idade 

We present an automated method for characterizing the effective elastic modulus of an ocular lens using a compression test.

Teste automatizado de compressão da lente ocular

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically ...

Aplicação sequencial de lamelas de vidro para avaliar a compressão Rigidez do Lens Mouse: tensão e morfométricas Análises

Resumo

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Imagem intravital longitudinal através de janelas de silicone claras

Síntese de elastômeros de silicone macio-ureia para aplicação de lente intra-ocular

Simulando a mecânica de lente Alojamento através de uma lente Manual esticador

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

Medição da rigidez de substratos de Silicone macio para estudos de Mechanobiology, usando um microscópio de fluorescência Widefield

Teste automatizado de compressão da lente ocular

Teste automatizado de compressão da lente ocular

Teste automatizado de compressão da lente ocular