This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במכון המחקר סקריפס. 1. עדשות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי המלצות המכונים הלאומיים לבריאות &quot;מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה&quot; ופרוטוקולי שימוש בבעלי חיים במוסד שאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העין מעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים. לדכא את הרקמה סביב העין עם מלקחיים כדי להביא את העין מתוך השקע, ואז לקטוף את העין מהשקע עם מלקחיים. עבר עיניים בופר פוספט 1x הטרי (PBS) בצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצב הראייה קרוב גלגל העין ככל האפשר. בעדינות ובזהירות להכניס פינצטה ישר עדין אל תוך גלגל העין דרך wher חורדואר עצב הראייה יוצא האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות עושים חתך במספריים לתוך גלגל העין מן אחורי אל הקצה של הקרנית. עדשות מכרסמות לכבוש ~ 30% של העין. ודא חתכים אלה בזהירות, ואל תכניס פינצטה או מספריים עמוק מדי לתוך העין כדי למנוע נזק העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לאורך המפגש בין הקרנית בלובן העין בבית חצי הדרך לפחות סביב גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף בעדינות את הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח שנעשה צעדי 1.4 ו -1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ישר טיפ נאים כדי להסיר כל פסולת גדולה בזהירות כי הוא עדיין מחובר העדשה. ראייה לבדוק את העדשה לכל נזק לפני שתמשיך המדידות נוקשות. </li></ol> 2. מדידות נוקשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול לפחות 10 coverslips מאותה תיבה באמצעות איזון אנליטיים. מצא את המשקל הממוצע של coverslips. לקבלת עקביות, השתמש באותה קופסת coverslips עבור כל הניסויים. טרום רטובבמראה coverslips ו-זווית ישרה ב PBS 1x בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2 לפני תחילת הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר המדיד (ראה איור 1) עם 65 - 75 מיליליטר של 1x PBS. תא המדידה נעשה מתוך פרספקס ידי חנות מכונת in-house, ואת divots בתא נעשה על ידי מקדחה מוגדרת לעומק הרצוי עם מקדח מתאים. עדשות לשמור על שקיפות ב 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך בדיקות מכניות. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> איור 1:. נוקשות מדידת לשכת תצלום מראה את הממדים של חדר המדידה נוקשת מחוייט עם מגוון רחב של divots עומקים שונים ובצורות שונות. Divots העגול 200 מיקרומטר או 300 מיקרומטר עמוק (ראשי חץ צהובים) משמש את המידות על עדשות עכבר. Divots הם 2 מ&quot;מ בקוטר ~ 13-. 14 מ&quot;מ מהקצה של החדר <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים המראים בזווית ישר לתוך התא במרחק קבוע מן השקע אשר ישמש כדי להחזיק את העדשה. ודא במראה לא זז במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשות העברת גזור לתא מדידה בקפידה עם מלקחיים לתפוס או מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה עליונה לאור העדשה פרקה ישר מלמעלה. קח תמונות העדשה העכבר 30X הגדלה עם תאורה מ מיקרוסקופ לנתח (למטה) ומקור אור סיבים אופטיים על הצדדים על ימין ועל שמאל. הגדר את אספקת החשמל סיבים אופטיים עד 80% של עוצמת האור המקסימלית. התאם את פלט אספקת החשמל מבוסס על תאורה מפוזרת, העדפות המשתמש ואת איכות התמונה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת נוף בצד של העדשה לא הטעונה, אשר ניתן לראות דרך רימראה ght-זווית. אם המצלמה אינה מכוילת, לצלם תמונה של הקצה המראה בפוקוס. קצה המראה באורך 5 מ&quot;מ, מדידה זו ניתן להשתמש מאוחר יותר כדי לקבוע את הפיקסלים / מ&quot;מ ולשמש סרגל קנה המידה של תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשת מקום לתוך השקע, ולאשר כי העדשה מונחת כהלכה ו ישר את השקע. קח תמונה של העדשה לפני הטעינה. העדשה צריכה להיות נחה את השקע על הקדמי שלה או בקוטב אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 coverslip בעדינות על העדשה. חכה 2 דקות כדי לאפשר שרץ, ולקחת עוד תמונת הצד להציג של העדשה הטעונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים להוסיף coverslips כמו בשלב 2.8 וצילמו-מבט מהצד לאחר תוספת של כל coverslip כמו בשלב 2.8 עד סך של 10 coverslips מוחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל coverslips. חכה 2 דקות, ולצלם תמונת נוף בצד של העדשה (ומחוץ לה את השקע) לאחר הסרת כל coverslips. </li></ol> 3. מדידת העדשה Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי determine בגודל גרעין העדשה, להזיז את העדשה אל צלחת נקייה פטרי מלא 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות decapsulate העדשה באמצעות מלקחיים ישר בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיל את תאי סיבי קליפת המוח על ידי גלגול העדשה בין אצבע עטוית כפפה. גרעין העדשה הנותר ירגיש כמו גולה קשה. השתמש בהליך זה כדי לבודד את הגרעין על עדשות מבוגרות מתחיל ב -1 לחודש של גיל. מאז הגרעין המבודד הוא גוף נוקשה, בדיקה מכאנית נוספת של גרעין העדשה לא יכולה להתבצע באמצעות שיטה מתוארת זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את גרעין העדשה 1x PBS בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גרעין העדשה בחזרה לתוך תא המדידה (לא את השקע), ולקחת תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית ישרה. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> איור 2:. עדשות עכבר דחוסים ידי Coverslips (א) סכמטי ו- (ב) תצלום של האקסהתקנת perimental מראה עדשת עכבר 2 בן חודש בתוך שקע 200 מיקרומטר עמוק בתוך תא המדידה מלא 1x PBS. מראה זווית נכונה ומצלמה דיגיטלית רכובה על מיקרוסקופ לנתיחה שמשו כדי לאסוף תמונות של העדשה במהלך דחיסה על ידי coverslips. (C) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type 2-בן חודש הדחוסה על ידי מספר הגדל והולך של coverslips ברציפות ספקו את הנתונים הגולמיים למדידת קטרים ​​ציריים משווניים וחישוב זנים ציריים משווניים במהלך בדיקת דחיסה מבוססת coverslip. השתקפות של העדשה ניתן לראות לפעמים את coverslips (רוב נראה בבירור בתמונה 1 coverslip). בעת ביצוע מדידות, להתעלם ההשתקפות ולמדוד אל הקודקוד של העדשה. (ד) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type בן חודש 2-דחיסת הדואר ועל גרעין העדשה המבודד. עדשת פוסט-דחיסת הגרעין מבודד ישב מחוץ את השקע. ברי סולם, 1 מ&quot;מ. נתון זה שונה מן Gokhב, et al. PLoS ONE, 2012 19. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ניתוח תמונה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד בקטרים ​​משווניים ו ציריים של עדשות לפני טעינה ואחרי כל שלב טעינה באמצעות ImageJ או תוכנה דומה. מדוד את הקוטר של כל גרעין העדשה. גרעין העדשה כמעט כדורי כך מדידה בכל אורינטציה תספיק 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העדשה צירית בקטרים ​​ידי הוספת עומק השקע בשימוש. בתא המדידה, את השקע הסתיר 200 מיקרומטר (עדשות עכבר 2-בן חודש) או 300 מיקרומטר (4 בן חודש ו -8 חודשים ישנות עדשות עכבר) של העובי הצירי של העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את צירית זנים משווניים מן מדידות קוטר עדשה באמצעות המשוואה, ε = (d - d 0) / ד 0, שם ε הוא זן, d הוא צירי או דוארקוטר quatorial בעומס נתון, ד 0 הוא בקוטר צירי או משווני המקביל בעומס אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירית זנים משווניים כפונקציה של העומס המוטל (במ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירי, הקו משווה ובקטרים ​​גרעיניים. לחשב ולתכנן את יחס ממדי עדשה על ידי חלוקה בקוטר הצירי ידי הקוטר המשווני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף העדשה באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r E 2 × r A, כאשר r E הוא רדיוס r המשווני הוא הרדיוס הצירי נמדד על פי התמונה לקחה צעד 2.6. משוואה זו מניחה העדשה היא אליפטית oblate (אליפסואיד) 1,22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף גרעיני באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r N 3, כאשר r N הוא רדיוס של גרעין העדשה כפי שהן נמדדות תמונה לקחה צעד 3.5. משוואה זו מניחה את i גרעין העדשהsa בתחום 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את השבר גרעיני כיחס בין היקף גרעיני בהיקף העדשה. </li></ol>

<ol>
	<li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the ocular lens. , (2004).</li><li>Piatigorsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+differentiation+in+vertebrates.+A+review+of+cellular+and+molecular+features.">Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features.</a> Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).</li><li>Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+accommodation:+surgical+options+for+correction+of+presbyopia.">Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia.</a> Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).</li><li>Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictionary of ophthalmic optics. , (1995).</li><li>Millodot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictionary of optometry and visual science. 7, (2009).</li><li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age:+the+basis+for+presbyopia.">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Mol Vis. 10, 956-963 (2004).</li><li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+heat:+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein,+alpha-crystallin,+in+maintaining+lens+flexibility.">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li><li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces.">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).</li><li>Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia.">optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li><li>Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude.">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).</li><li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses.">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+the+human+lens.">Elastic properties of the human lens.</a> Exp Eye Res. 11 (1), 143 (1971).</li><li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium:+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses.">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li><li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens.">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+the+optical+changes+in+the+human+crystalline+lens+with+age.">Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age.</a> Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).</li><li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia.">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li><li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force.">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li><li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lens+stiffness+measurements.">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens.">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth:+I.+Nonprimate+lenses.">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם מספר שיקולים מרכזיים בעת שימוש בשיטה זו כדי למדוד נוקשות עדשה. ראשית, coverslips מוחלים על העדשה בזווית אלכסונית מעט (8 - 8.5 °) ביחס לחלק התחתון של החדר (θ). זה יחול מרכיב קטן מאוד של עומס equatorially ולא axially. עם זאת, עומס משווני זה נחשב זניח בגלל חטא θ ≈ 0.1 19. אם שיטה זו מות...

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table><tbody><tr><td>Fine tip straight forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors, straight edge</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Seizing forceps</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Dissection dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Measurement chamber with divots to hold lenses</td><td></td><td></td><td>Custom-made (see &lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>Right-angle mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>Illuminated dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>With SZ-PT phototube</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

עדשת העין היא איבר שקוף כי ומשגרת ומתמקד אור כדי ליצור תמונה ברורה על הרשתית. אצל בני אדם, שרירים מתכווצים ריסים כדי לעוות את העדשה, מה שמוביל לעלייה בכוחה האופטי &#39;העדשה להתמקד בעצמים קרובים, תהליך המכונה אירוח. גיל הקשורים שינויים נוקשים עדשה קושרו פרסביופיה, הפחתת העדשה &#39;היכולת להכיל, ובהרחבה, את הצורך במשקפי קריאה. למרות עדשות עכבר אינה להתאים או לפתח פרסביופיה, במודלים של עכברים יכולים לספק כלי רב ערך עבור גנטי פתולוגיות עדשת הבנה, וההזדקנות המואצת נצפתה בעכברים מאפשרת הלימוד של שינויים הקשורים בגיל בעדשה. פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה, מדויקת, וחסכונית לקביעת נוקשות עדשת עכבר, באמצעות coverslips זכוכית ליישם ברצף הגדלת עומסי דחיסה על גבי העדשה. נציג נתונים לאשר עדשות העכבר להיות נוקשה עם הגיל, כמועדשות אדם. שיטה זו היא מאוד לשחזור ואף עלול להיות מדורג עד מכנית עדשות מבחן מחיות גדולות יותר.

הנוקשות והממדים של 2, 4 ו 8 חודשים ישני עדשות עכבר נמדדו. עכברים היו כל wild-type חיות על רקע המתח טהור C57BL6 המתקבל מתקן גידול בעלי חיים TSRI, ואת כל עדשה היתה עמוסה 1 עד 10 coverslips. הזנים הציריים משווניים חושבו כפונקציה של עומס המופעל על ידי מדידה הצירית ובקטרי קו ...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses at JoVE.com

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

sequential-application-glass-coverslips-to-assess-compressive

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Views.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Video: Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging windows is particularly powerful because it allows longitudinal observation of the same tissue over days to weeks. Typical imaging windows comprise a glass coverslip in a biocompatible metal frame sutured to the mouse&#8217;s skin. These windows can interfere with the free movement of the mice, elicit a strong inflammatory response, and fail due to broken glass or torn sutures, any of which may necessitate euthanasia. To address these issues, windows for long-term abdominal organ and mammary gland imaging&#160;were developed from a thin film of polydimethylsiloxane (PDMS), an optically clear silicone polymer previously used for cranial imaging windows. These windows can be glued directly to the tissues, reducing the time needed for insertion. PDMS is flexible, contributing to its durability in mice over time&#8212;up to 35 days have been tested. Longitudinal imaging is imaging of the same tissue region during separate sessions. A stainless-steel grid was embedded within the windows to localize the same region, allowing the visualization of dynamic processes (like mammary gland involution) at the same locations, days apart. This silicone window also allowed monitoring of single disseminated cancer cells developing into micro-metastases over time. The silicone windows used in this study are simpler to insert than metal-framed glass windows and cause limited inflammation of the imaged tissues. Moreover, embedded grids allow for straightforward tracking of the same tissue region in repeated imaging sessions.

An approach is here presented for long-term intravital imaging using optically clear, silicone windows that can be glued directly to the tissue/organ of interest and the skin.&#160;These windows are cheaper and more versatile than others currently used in the field, and the surgical insertion causes limited inflammation and distress to the animals.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Cancer Research

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved through the contraction of the ciliary body and relaxation of zonule fibers, which results in the thickening of the lens necessary for near vision. Here, we present a novel, simple method in which accommodation is replicated by tensing the zonules connected to the lens capsule via a manual lens stretcher (MLS). This method monitors the radial stretching achieved by a lens when subjected to a consistent force and allows for a comparison of accommodating lenses, which can be stretched, to non-accommodating lenses, which cannot be stretched. Importantly, the stretcher couples to the zonules directly, and not to the sclera of the eye, thus only requiring the lens, zonules, and ciliary body rather than the entire globe sample. This difference can significantly decrease the cost of acquiring donor cadaver lenses by about 62% compared to acquiring an entire globe.

We present an efficient method of studying lens accommodation by using a manual lens stretcher. The protocol mimics physiological accommodation by pulling the zonules connected around the lens capsule, thereby, stretching the lens.

כדי לדמות את המכניקה של העדשה לינה דרך אלונקה מדריך עדשה

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Bioengineering

צביעה אימונופלואורסצנטית של אינטרדיגיטציות ממברנות בתאי סיבי עדשה

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear image. The bulk of this tissue comprises specialized, differentiated fiber cells that have a hexagonal cross section and extend from the anterior to the posterior poles of the lens. These long and skinny cells are tightly opposed to neighboring cells and have complex interdigitations along the length of the cell. The specialized interlocking structures are required for normal biomechanical properties of the lens and have been extensively described using electron microscopy techniques. This protocol demonstrates the first method to preserve and immunostain singular as well as bundles of mouse lens fiber cells to allow the detailed localization of proteins within these complexly shaped cells. The representative data show staining of the peripheral, differentiating, mature, and nuclear fiber cells across all regions of the lens. This method can potentially be used on fiber cells isolated from lenses of other species.

מחבר Spotlight: Advanceancing Lens Biomechanics Research through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining 

This protocol describes methods to prepare peripheral, mature, and nuclear eye lens fiber cells for immunofluorescence staining to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture.

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Developmental Biology

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

אפיון ביומכני של עדשת עין חזירית עם דחיסה אוטומטית

Automated Compression Testing of the Ocular Lens

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically with age in the human lens, resulting in a loss of near vision called presbyopia. However, the mechanisms of these changes remain unknown. Lens compression offers a relatively simple method for assessing the lens' biomechanical stiffness in a qualitative sense and, when coupled with appropriate analytical techniques, can help quantify biomechanical properties. A variety of lens compression tests have been performed to date, including both manual and automated, but these methods inconsistently apply key aspects of biomechanical testing such as preconditioning, loading rates, and time between measurements. This paper describes a fully automated lens compression test wherein a motorized stage is synchronized with a camera to capture the force, displacement, and shape of the lens throughout a preprogrammed loading protocol. A characteristic elastic modulus may then be calculated from these data. While demonstrated here using porcine lenses, the approach is appropriate for the compression of lenses of any species.

מחבר זרקור: קידום ההבנה של שינויים בנוקשות עדשות תלויות גיל 

We present an automated method for characterizing the effective elastic modulus of an ocular lens using a compression test.

בדיקת דחיסה אוטומטית של עדשת העין

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

כדי לדמות את המכניקה של העדשה לינה דרך אלונקה מדריך עדשה

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

בדיקת דחיסה אוטומטית של עדשת העין

בדיקת דחיסה אוטומטית של עדשת העין

בדיקת דחיסה אוטומטית של עדשת העין

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה