This work was supported by National Eye Institute Grant R01 EY017724 (VMF) and National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534 (DSG).

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health e sotto un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali al The Scripps Research Institute. 1. Obiettivo dissezione <ol><li> Euthanize topi in base alle raccomandazioni del National Institutes of Health &quot;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&quot; e approvati utilizzano protocolli istituzione animali. </li><li> Enucleate l&#39;occhio da topo, utilizzando pinze curve. Premere il tessuto intorno l&#39;occhio con le pinze per portare l&#39;occhio dalla presa di corrente, e quindi cogliere l&#39;occhio dalla presa con le pinze. Trasferire gli occhi di fresco 1x tampone fosfato salino (PBS) nel piatto dissezione. </li><li> Tagliare il nervo ottico più vicino al bulbo oculare possibile. Delicatamente e con attenzione inserire sottili pinzette direttamente nel bulbo oculare attraverso il foro di where il nervo ottico esce dal posteriore. </li><li> fare attenzione un&#39;incisione con le forbici nel bulbo oculare dal posteriore al bordo della cornea. Lenti roditori occupano circa il 30% degli occhi. Fare queste incisioni attentamente, e non inserire le pinzette o forbici troppo in profondità nell&#39;occhio per evitare di danneggiare l&#39;obiettivo. </li><li> Tagliare lungo la giunzione tra la cornea e nella sclera almeno mezzo giro del bulbo oculare. </li><li> Premere delicatamente sulla cornea per rimuovere la lente dall&#39;occhio attraverso l&#39;apertura fatta in passi 1.4 e 1.5. </li><li> Utilizzare pinza sottile punta diritta per rimuovere attentamente qualsiasi detriti di grandi dimensioni che è ancora attaccato alla lente. Visivamente la lente di eventuali danni prima di procedere con le misurazioni di rigidità. </li></ol> 2. Rigidità Misure <ol><li> Pesare almeno 10 vetrini dalla stessa scatola con una bilancia analitica. Trova il peso medio delle lamelle. Per coerenza, utilizzare la stessa confezione di lamelle per tutti gli esperimenti. Pre-bagnatoil coprioggetto e ad angolo retto specchio in 1x PBS a temperatura ambiente per almeno 2 ore prima di avviare esperimenti. </li><li> Riempire la camera di misura (vedi figura 1) con 65 - 75 ml di PBS 1x. La camera di misurazione è stata fatta di plexiglas da un negozio di macchina in-house, e divots nella camera sono state fatte da un trapano a colonna impostato per la profondità desiderata con una punta da trapano appropriata. Lenti rimangono trasparenti in 1x PBS a temperatura ambiente per la durata della prova meccanica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> Figura 1:. Rigidità camera di misura Una fotografia che mostra le dimensioni della camera di misura rigidità misura con una varietà di zolle di diverse profondità e forme. Le zolle rotonde che si trovano a 200 micron o 300 micron di profondità (punte di freccia di colore giallo) sono utilizzati per le misurazioni su lenti del mouse. Divots sono 2 mm di diametro e 13 ~-. 14 mm dal bordo della camera <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Posizionare specchio ad angolo nella camera ad una distanza costante dal incavo che verrà utilizzato per tenere la lente. Assicurarsi che lo specchio non si sposta durante l&#39;esperimento. </li><li> Trasferire lenti sezionati per camera di misura con attenzione con una pinza sequestro o pinze curve. </li><li> Prendete una vista dall&#39;alto immagine della lente scaricato da sopra la sua testa. Prendete il mouse foto di lenti a 30X di ingrandimento con illuminazione da dissezione microscopio (in basso) e una sorgente di luce in fibra ottica sui lati destro e sinistro. Impostare l&#39;alimentazione fibra ottica al 80% della massima intensità luminosa. Regolare la potenza di alimentazione sulla base di illuminazione ambientale, preferenze dell&#39;utente e la qualità dell&#39;immagine in base alle esigenze. </li><li> Dai vista laterale immagine della lente a vuoto, che può essere visto attraverso la rispecchio GHT angolo. Se la telecamera non è calibrato, scattare una foto del bordo specchio a fuoco. Il bordo dello specchio è lungo 5 mm, e questa misurazione può successivamente essere utilizzato per determinare il pixel / mm e servire come una barra di scala nelle immagini. </li><li> Posizionare lente nel divot, e confermare che l&#39;obiettivo sia inserito in modo sicuro e dritto in incavo. Scatta una foto della lente prima di caricarla. L&#39;obiettivo deve essere appoggiato nella zolla sulla sua anteriore o polo posteriore. </li><li> Mettere 1 coprioggetto delicatamente sulla lente. Attendere 2 minuti per consentire al creep, e prendere un altro vista laterale immagine della lente caricato. </li><li> Continuare ad aggiungere vetrini come al punto 2.8 e prendendo lato-vista le immagini dopo l&#39;aggiunta di ogni vetrino come al punto 2.8 fino a quando vengono applicati un totale di 10 lamelle. </li><li> Rimuovere tutte le lamelle. Attendere 2 minuti, e prendere una vista laterale immagine della lente (all&#39;interno e all&#39;esterno del divot) dopo aver rimosso tutte le lamelle. </li></ol> Misurazione 3. Obiettivo Nucleus <ol><li> per determine la dimensione nucleo della lente, spostare l&#39;obiettivo di un piatto pulito Petri riempita con PBS 1x. </li><li> decapsulate delicatamente la lente con pinza sottile diritte. </li><li> Spogliarci di cellule corticali fibra facendo rotolare la lente tra le dita guantate. Il nucleo della lente rimanente si sentirà come un marmo duro. Utilizzare questa procedura per isolare il nucleo sulle lenti per adulti a partire da 1 mese di età. Poiché il nucleo isolato è un corpo rigido, ulteriori prove meccaniche del nucleo lente non può essere eseguita utilizzando il metodo descritto. </li><li> Lavare delicatamente il nucleo della lente in 1x PBS nella scatola di Petri. </li><li> Posizionare il nucleo obiettivo posteriore nella camera di misura (non nel divot), e prendere una immagine del nucleo lente attraverso lo specchio ad angolo retto. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> Figura 2:. A Lenti mouse compresso dal Coprioggetto (A) Schema e (B) fotografia della exl&#39;installazione sperimentale che mostra un 2 mesi lente del mouse in una zolla di 200 micron di profondità nella camera di misura piena di PBS 1x. Uno specchio angolo retto e una fotocamera digitale montata su un microscopio dissezione stati usati per raccogliere le immagini della lente durante la compressione da coprioggetto. (C) Foto di viste sagittali di 2 mesi lente wild-type compressa in successione un numero crescente di vetrini fornito i dati grezzi per misurare i diametri assiali ed equatoriali e calcolando ceppi assiali ed equatoriali durante i test di compressione vetrino-based. Una riflessione della lente a volte può essere visto in i coprioggetti (più chiaramente visibile l&#39;immagine del 1 vetrino in). Quando si effettuano misurazioni, ignorare il riflesso e misurare all&#39;apice della lente. (D) Foto di vista sagittale del 2 mesi lente wild-type post-compressione e il nucleo della lente isolato. L&#39;obiettivo post-compressione e nuclei isolati sono seduti al di fuori della incavo. Barre di scala, 1 mm. Questa cifra viene modificato da Gokhin, et al. PLoS ONE 2012 19. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Analisi 4. Immagine <ol><li> Misurare i diametri equatoriale e assiali delle lenti prima del carico e dopo ogni fase di carico utilizzando ImageJ o software simili. Misurare il diametro di ogni nucleo lente. Il nucleo della lente è quasi sferica così una misura in qualsiasi orientamento sarà sufficiente 19,21. </li><li> Correggere la lente assiale diametri aggiungendo la profondità incavo utilizzato. Nella camera di misura, incavo oscurata 200 micron (lenti 2 mesi di età topo) o 300 micron (lenti 4 mesi di età e 8 mesi di età mouse) dello spessore assiale della lente. </li><li> Calcolare il assiale e ceppi equatoriali dalle misurazioni del diametro della lente utilizzando l&#39;equazione, ε = (d - d 0) / d 0, dove ε è la deformazione, d è la assiale o ediametro Quatorial a un determinato carico, e d 0 è il diametro assiale o equatoriale corrispondente al carico nullo. </li><li> Tracciare assiale e ceppi equatoriali come funzioni del carico imposto (in mg). </li><li> Tracciare assiale, equatoriale e diametri nucleari. Calcolare e tracciare le proporzioni obiettivo dividendo il diametro assiale dal diametro equatoriale. </li><li> Calcolare e tracciare il volume della lente utilizzando l&#39;equazione, volume = 4/3 × π × R e 2 × R A, dove r è il raggio E e R equatoriale A è il raggio assiale misurata dalla foto scattata nella fase 2.6. Questa equazione presuppone la lente è uno sferoide oblato (ellissoide) 1,22. </li><li> Calcolare e tracciare il volume nucleare utilizzando l&#39;equazione, volume = 4/3 × π × r N 3, dove r N è il raggio del nucleo cristallino come misurata dalla foto scattata al passo 3.5. Questa equazione assume il I nucleo della lentesa sfera 19,21. </li><li> Calcolare e tracciare la frazione nucleare come il rapporto tra il volume nucleare per il volume obiettivo. </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses.">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+the+human+lens.">Elastic properties of the human lens.</a> Exp Eye Res. 11 (1), 143 (1971).</li><li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium:+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses.">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li><li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens.">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li><li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presbyopia+and+the+optical+changes+in+the+human+crystalline+lens+with+age.">Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age.</a> Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).</li><li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia.">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li><li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force.">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li><li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lens+stiffness+measurements.">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li><li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens.">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth:+I.+Nonprimate+lenses.">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy.">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diverse considerazioni importanti quando si utilizza questo metodo per misurare la rigidità della lente. Innanzitutto, i coprioggetti sono applicati alla lente con un angolo leggermente obliqua (8 - 8,5 °) rispetto al fondo della camera (θ). Questo si applica una piccola componente del carico equatoriale piuttosto che assialmente. Tuttavia, questo carico equatoriale è considerata trascurabile, perché il peccato θ ≈ 0.1 19. Se questo metodo è adattato per lenti più grandi, l&#39;angolo delle ...

The lens is a transparent and avascular organ in the anterior chamber of the eye that is responsible for fine focusing of light onto the retina. A clear basement membrane, called the lens capsule, surrounds a bulk of elongated fiber cells covered by an anterior monolayer of epithelial cells1,2. Life-long growth of the lens depends on the continuous proliferation and differentiation of epithelial cells at the lens equator into new fiber cells that are added onto previous generations of fiber cells in a concentric manner2. Over time, lens fiber cells undergo compaction, resulting in a rigid center in the middle of the lens called the nucleus1. Accommodation, defined as a dioptric change in the optical power of the eye, occurs in humans when the ciliary muscles contract to deform the lens and allow a true increase in optical power to focus on near objects3-5. In the unaccommodated eye, the lens is held in a relatively flattened state due to tension from zonular fibers. When the ciliary muscles contract, the tension on the lens is released, leading to decreased lens equatorial diameter and increased axial thickness. Age-related changes in the lens cause presbyopia, a progressive loss of lens accommodation, which leads to the need for reading glasses. 
Several studies have linked presbyopia to age-related increase in the intrinsic stiffness of the lens6-11. Stiffness is defined as the resistance of an elastic object to deform under applied load. A variety of methods have been used to examine stiffness of human lenses, including spin compression12-14, actuator compression15, probe indentation16, dynamic mechanical analysis 6,10 and bubble-based acoustic radiation force17. While mouse lenses do not accommodate or develop presbyopia, mouse models for lens pathologies are valuable tools because mice are less expensive than larger animals, well characterized genetically and undergo accelerated age-related changes due to rapid aging. A handful of studies have examined mouse lens stiffness with compression methods and demonstrated changes in lens stiffness due to aging or targeted genetic disruptions18-21. Thus, mouse lenses are good models for studying age-related changes in lens stiffness. 
This protocol describes a simple and inexpensive, yet precise and reproducible, compression method for determining mouse lens stiffness based on application of glass coverslips onto the lens in conjunction with photographing the lens through a dissection microscope and mirror. This method yields robust strain and morphometric data with an easily fabricated and assembled apparatus. The representative results confirm that mouse lenses increase in stiffness with age.

<table><tbody><tr><td>Fine tip straight forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors, straight edge</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Seizing forceps</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Dissection dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 mm glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Measurement chamber with divots to hold lenses</td><td></td><td></td><td>Custom-made (see &lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>Right-angle mirror</td><td>Edmund Optics</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>Illuminated dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX-ILLD100</td><td>With SZ-PT phototube</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses

La lente occhio è un organo trasparente che rifrange e si concentra la luce per formare una chiara immagine sulla retina. Negli esseri umani, contratto di muscoli ciliari deformare la lente, portando ad un aumento della potenza ottica della lente di concentrarsi su oggetti vicini, un processo noto come alloggio. Cambiamenti legati all&#39;età in rigidità lente sono stati collegati a presbiopia, una riduzione nella lente &#39;possibilità di ospitare, e, per estensione, la necessità di occhiali da lettura. Anche se le lenti del mouse non ospitare o sviluppare presbiopia, modelli di mouse in grado di fornire uno strumento genetico prezioso per patologie lenti comprensione, e l&#39;invecchiamento accelerato osservato nei topi permette lo studio dei cambiamenti legati all&#39;età nella lente. Questo protocollo dimostra un metodo semplice, preciso e conveniente per determinare la rigidità della lente del mouse, utilizzando vetrini da applicare in sequenza crescente carichi di compressione sulla lente. Dati rappresentativi confermano che le lenti del mouse diventano più rigidi con l&#39;età, comelenti umani. Questo metodo è altamente riproducibile e può potenzialmente essere scalata fino a meccanicamente le lenti di prova da animali più grandi.

La rigidità e dimensioni di 2, 4 e 8 mesi di età lenti di topo sono stati misurati. I topi sono stati tutti gli animali wild-type su un puro C57BL6 ceppo sfondo ottenuto dal Fondo Allevamento TSRI degli animali, e ogni obiettivo è stato caricato con da 1 a 10 lamelle. I ceppi assiali ed equatoriali sono stati calcolati in funzione del carico applicato misurando assiale e diametri equatoriale della lente dopo l&#39;aggiunta di ciascun vetrino, quindi normalizzare ogni variazione di dia...

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Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Sequenziale Applicazione di vetrini di vetro per valutare la compressione Rigidità della lente Mouse: Strain e morfometriche analisi

Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

sequential-application-glass-coverslips-to-assess-compressive

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Views.  The Scripps Research Institute. Age-related increases in eye lens stiffness are linked to presbyopia. This protocol describes a simple, cost-effective method for measuring mouse lens stiffness. Mouse lenses, like human lenses, become stiffer with age. This method is precise and can be adapted for lenses from larger animals.

Video: Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging windows is particularly powerful because it allows longitudinal observation of the same tissue over days to weeks. Typical imaging windows comprise a glass coverslip in a biocompatible metal frame sutured to the mouse&#8217;s skin. These windows can interfere with the free movement of the mice, elicit a strong inflammatory response, and fail due to broken glass or torn sutures, any of which may necessitate euthanasia. To address these issues, windows for long-term abdominal organ and mammary gland imaging&#160;were developed from a thin film of polydimethylsiloxane (PDMS), an optically clear silicone polymer previously used for cranial imaging windows. These windows can be glued directly to the tissues, reducing the time needed for insertion. PDMS is flexible, contributing to its durability in mice over time&#8212;up to 35 days have been tested. Longitudinal imaging is imaging of the same tissue region during separate sessions. A stainless-steel grid was embedded within the windows to localize the same region, allowing the visualization of dynamic processes (like mammary gland involution) at the same locations, days apart. This silicone window also allowed monitoring of single disseminated cancer cells developing into micro-metastases over time. The silicone windows used in this study are simpler to insert than metal-framed glass windows and cause limited inflammation of the imaged tissues. Moreover, embedded grids allow for straightforward tracking of the same tissue region in repeated imaging sessions.

An approach is here presented for long-term intravital imaging using optically clear, silicone windows that can be glued directly to the tissue/organ of interest and the skin.&#160;These windows are cheaper and more versatile than others currently used in the field, and the surgical insertion causes limited inflammation and distress to the animals.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Simulating the Mechanics of Lens Accommodation via a Manual Lens Stretcher

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved through the contraction of the ciliary body and relaxation of zonule fibers, which results in the thickening of the lens necessary for near vision. Here, we present a novel, simple method in which accommodation is replicated by tensing the zonules connected to the lens capsule via a manual lens stretcher (MLS). This method monitors the radial stretching achieved by a lens when subjected to a consistent force and allows for a comparison of accommodating lenses, which can be stretched, to non-accommodating lenses, which cannot be stretched. Importantly, the stretcher couples to the zonules directly, and not to the sclera of the eye, thus only requiring the lens, zonules, and ciliary body rather than the entire globe sample. This difference can significantly decrease the cost of acquiring donor cadaver lenses by about 62% compared to acquiring an entire globe.

We present an efficient method of studying lens accommodation by using a manual lens stretcher. The protocol mimics physiological accommodation by pulling the zonules connected around the lens capsule, thereby, stretching the lens.

Simulando la meccanica del Lens Alloggio tramite una barella lente manuale

The goal of this protocol is to mimic the biomechanics of physiological accommodation in a cost-efficient, practical manner. Accommodation is achieved ...

Bioingegneria

Colorazione in immunofluorescenza delle interdigitazioni di membrana nelle cellule delle fibre del cristallino

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear image. The bulk of this tissue comprises specialized, differentiated fiber cells that have a hexagonal cross section and extend from the anterior to the posterior poles of the lens. These long and skinny cells are tightly opposed to neighboring cells and have complex interdigitations along the length of the cell. The specialized interlocking structures are required for normal biomechanical properties of the lens and have been extensively described using electron microscopy techniques. This protocol demonstrates the first method to preserve and immunostain singular as well as bundles of mouse lens fiber cells to allow the detailed localization of proteins within these complexly shaped cells. The representative data show staining of the peripheral, differentiating, mature, and nuclear fiber cells across all regions of the lens. This method can potentially be used on fiber cells isolated from lenses of other species.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla biomeccanica delle lenti attraverso un nuovo protocollo per l'imaging di interdigitazioni complesse e colorazione delle proteine 

This protocol describes methods to prepare peripheral, mature, and nuclear eye lens fiber cells for immunofluorescence staining to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture.

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Biologia dello sviluppo

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Biologia

Caratterizzazione biomeccanica del cristallino oculare suino con compressione automatizzata

Automated Compression Testing of the Ocular Lens

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically with age in the human lens, resulting in a loss of near vision called presbyopia. However, the mechanisms of these changes remain unknown. Lens compression offers a relatively simple method for assessing the lens' biomechanical stiffness in a qualitative sense and, when coupled with appropriate analytical techniques, can help quantify biomechanical properties. A variety of lens compression tests have been performed to date, including both manual and automated, but these methods inconsistently apply key aspects of biomechanical testing such as preconditioning, loading rates, and time between measurements. This paper describes a fully automated lens compression test wherein a motorized stage is synchronized with a camera to capture the force, displacement, and shape of the lens throughout a preprogrammed loading protocol. A characteristic elastic modulus may then be calculated from these data. While demonstrated here using porcine lenses, the approach is appropriate for the compression of lenses of any species.

Autore in primo piano: Migliorare la comprensione dei cambiamenti di rigidità delle lenti legati all'età 

We present an automated method for characterizing the effective elastic modulus of an ocular lens using a compression test.

Test di compressione automatizzato della lente oculare

The biomechanical properties of the ocular lens are essential to its function as a variable power optical element. These properties change dramatically ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Sequenziale Applicazione di vetrini di vetro per valutare la compressione Rigidità della lente Mouse: Strain e morfometriche analisi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Simulando la meccanica del Lens Alloggio tramite una barella lente manuale

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

Test di compressione automatizzato della lente oculare

Test di compressione automatizzato della lente oculare

Test di compressione automatizzato della lente oculare

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita