R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados ​​nestas sínteses são altamente tóxicos e cancerígenos. Todas as etapas que envolvem solventes orgânicos prejudiciais à saúde, especialmente a extração dos produtos da reacção e da derivação de ácidos graxos deve ser realizado sob um exaustor utilizando equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calças compridas, sapatos fechados ). Todas as operações que envolvam organismos geneticamente modificados neste trabalho necessitam de instalações que são aprovados para a manipulação de organismos geneticamente modificados do S1 nível de segurança. 1. A expressão da descarboxilase recombinante em E. OLET JE coli <ol><li> Preparação da estirpe de produção <ol><li> Preparar um gene sintético de JE a partir OLET Jeotgalicoccus e clonado no vector de expressão de pASK-IBA37plus como descrito. 8 </sup&gt; NOTA: Para evitar a degradação de ácidos graxos por enzimas do metabolismo bacteriano, E. foi usada coli estirpe JW5020 da coleção Keio com um caminho disfuncional para a degradação de ácidos graxos. </li></ol></li><li> O cultivo e a indução da expressão da enzima <ol><li> Prepara-se uma pré-cultura por inoculação a E. coli JW5020 OLET mutante a partir de uma placa de LB-(contendo 100? g ml-1 de ampicilina) em dois 3 ml de LB médio em tubos de ensaio. Pipeta ampicilina (100 ug mL-1) a partir de uma solução de estoque para o meio de selecção e incubar a 37 ° C durante 15 h num incubador com agitação a 180 rpm. </li><li> Adicionar 2 ml das pré-culturas para dois 200 ml de LB médio, contendo ampicilina (100 ug mL-1), em frascos de 1 L de agitação. A incubação decorre a 37 ° C e 180 rpm. </li><li> Monitorar a mudança de 600nm OD após a inoculação. Quando a DO600 atinge um valor entre 0,6 umd 0,8 induzir a expressão por adição de tetraciclina (0,2 mg ml-1). Incubam-se as culturas durante 15 horas a 20 ° C e 180 rpm. Observação: Uma vez que OLET JE contém um cofactor do heme, é necessária a adição de ácido levulínico δ-amino (0,5 mM) antes da indução para proporcionar a cultura com um precursor para a síntese do co-factor. </li></ol></li><li> A lise celular <ol><li> Realizar os seguintes passos no gelo. Transferir as culturas por decantação ou pipetagem para tubos de centrífuga e usar uma escala para assegurar a igualdade de distribuição. Centrifugar as culturas durante 20 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente descartar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 50 ml de tampão (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) por pipetagem e transferir a suspensão em um tubo de centrífuga cónico. </li><li> Após centrifugação durante 15 min a 4000 xg, a 4 ° C descartar o sobrenadante, ressuspender cada sedimento em 3 ml de tampão por pipetagem. </li><li> Realizar a lise celular por assimnicar as soluções em gelo (três ciclos x 30 s), deixando uma pausa de 1 min entre os ciclos. Centrifugar as soluções durante 20 minutos a 15000 xg, a 4 ° C para remover os restos de células e transferir o sobrenadante para um tubo de centrifugação cónico, sem perturbar o sedimento por pipetagem. Descartar o sedimento. NOTA: Uma fracção de solvente será utilizado directamente para a biocatálise depois de moléculas pequenas são removidos. A segunda fracção irá ser utilizada para a purificação do OLET JE marcada com His. </li></ol></li><li> A remoção de pequenas moléculas de adesão célula-extractos <ol><li> Antes de utilizar o extracto em bruto na biocatálise remover pequenas moléculas que possam interferir com a formação de peróxido de hidrogénio ou a transferência de electrões por pipetagem 3 ml de extracto isento de células numa unidade de filtro de centrifugação, utilizando uma membrana de 10 kDa e centrifugar a 4000 xg, a 4 ° C. Ressuspender a proteína restante em 3 ml de Tris-HCl-tampão. </li></ol></li><li> A purificação do OLET </strong&gt; <ol><li> Aplicar 3 ml de extracto celular a segunda aos Seus colunas de giro Pur Ni-NTA, que tenham sido equilibrada antes com tampão de equilíbrio (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). </li><li> Selar as colunas com os plugues de fundo e parafuso-tampões superiores e agitá-los levemente até que a resina é distribuído igualmente com o extrato livre de células. Incubar as colunas carregadas durante 30 min num agitador vertical, a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as colunas com 1 ml de tampão de lavagem (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4) por centrifugação a 700 xg durante 2 min. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Colocar as colunas para um tubo de centrifugação cónico fresca e adicionar 1 ml de tampão de eluição (Tris a 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Centrifugar a 700 xg durante 2 minutos e repita esta etapa duas vezes. NOTA: Imidazole se ligará ao níquel e, assim, remover OLET JE a partir da coluna. </li><li> Transfira a eluição de uma unidade de filtro de centrífuga (10 mem kDabrana) e centrifugar a 4000 xg, a 4 ° C para remover o imidazole. </li><li> Verifique a pureza da enzima por um SDS-PAGE (15%). 9 3 ul da mistura da eluição com um tampão de SDS-(1x concentração final) e incubar a solução a 95 ° C durante 5 min para a desnaturação. Subsequentemente aplicam-se a quantidade total de uma SDS-PAGE. Submeter o gel a 35 mA utilizando um padrão de proteína comerciais. Detectar a proteína de 50 kDa. </li><li> Para determinar a concentração de proteína disponível usar um BSA-kit comercial. Pipetar 50 ul de amostras de proteína (diluído 1: 100, 1: 200, 1: 500) e o padrão de BSA (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg mL -1) em uma placa de 96 poços . Adicionar 200 ul de reagente de Bradford, medir a absorvância a 595 nm após 15 min com um fluorímetro e calcular as concentrações utilizando a curva padrão. </li></ol></li></ol> 2. Biotransformação de luz catalisada <ol><li> Reacções biocatalíticas sem adição de peróxido de hidrogénio<ol><li> Prepara-se uma solução de 10 ml de estoque de 10 mM de ácido esteárico (M r 284,5 g mol-1) por adição de 10% (v / v) de Tergitol e 0,0284 g de ácido esteárico a água destilada. Aquece-se a solução em uma câmara de aquecimento a 60 ° C até que o ácido gordo é completamente dissolvido. </li><li> Biocatálise e amostragem <ol><li> Preparar dois 2 ml misturas reaccionais contendo 50 mM de EDTA, 0,01 mM de FMN, ácido esteárico 0,5 mM em Tris-HCl-tampão. Adicionar uma barra de agitação magnética para fornecimento de oxigénio suficiente e colocar os tubos de vidro num banho de água, aquecida a 25 ° C. </li><li> Adicionar 200? G ml -1 de enzima purificada ou 10% (v / v) extracto isento de células de cada uma das misturas de reacção e iluminar-los com uma ampola de vidro clara (120 W) em 15 cm de distância dos tubos de reacção. </li><li> Aqui amostras de 200 ul em pontos de tempo específicos (0, 10, 30, 60 e 120 min) e durante a noite a paragem da reacção com HCl a 20 ul de 37%. Adicionar 5 mL de ácido mirístico (10 mM de modolução) como padrão interno. </li></ol></li></ol></li><li> Análise dos produtos de reacção <ol><li> Para a extracção adicionar 500 mL de acetato de etilo às amostras duas vezes, inverter os tubos e centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. </li><li> Tire 400 ul do sobrenadante e deixar o solvente evaporar completamente. </li><li> Derivatizar os ácidos carboxílicos em ácido trimethylsilylcarboxylic por adição de 200 uL de N-metil-N - (trimetilsilil) trifluoro- acetamida (MSTFA). Incubar a solução a 60 ° C durante 30 minutos, a fim de converter os grupos hidroxilo para trimetilsilil éteres. </li><li> Determinação de conversão por GC / FID NOTA: Determinar a formação de 1-heptadeceno (RT: 8,34 min), ácido esteárico e α- β-hidroxi (RT: 12,05 e 12,1 min) e diminuição do substrato (RT: 11,15 min) utilizando GC / FID. <ol><li> Defina o perfil de temperatura descrito abaixo Defina a temperatura de injecção de 340 ° C. Aguardea temperatura do forno inicial é a 90 ° C durante 3,5 min e, subsequentemente, aumentar a 45 ° C min-1. A 220 ° C, mantida a temperatura durante 2 min. Depois de um aumento repetido de 45 ° C min @ 1, manter a temperatura a 280 ° C durante 2 min e, em seguida, aumentam com a 60 ° C min-1. NOTA: A temperatura máxima de 330 ° C é mantida por 1,44 min. </li><li> Injectar 4 ul da amostra, com uma razão de divisão de 5 a obter a volatilização rápida e a mistura homogénea com o hélio gás portador. NOTA: Em dependência do aumento da temperatura do substrato e dos produtos vai entrar na fase gasosa. As substâncias são detectados pelo detector / FID GC após a passagem da coluna a tempos de retenção específicos e são apresentados como picos no ecrã. Observar a formação de pico no monitor. </li><li> Calcula-se a concentração do produto formado pela seguinte fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; NOTA: O factor de calibração foi determinada especificamente para esta coluna para cada substrato e do produto através do cálculo da curva padrão a partir de quantidades conhecidas de substâncias derivadas e sua área de pico correspondente. </li></ol></li><li> Identificar picos de ácidos olefínicos e beta-hidroxi por GC / MS. <ol><li> Identificar picos de ácidos olefínicos e beta-hidroxi por GC / MS. Defina o perfil de temperatura. Ajustar a temperatura de injecção de 250 ° C. Mantenha a temperatura do forno a 100 ° C durante 5 min e, subsequentemente, aumentar a 20 ° C min-1. NOTA: Máximo temperatura é mantida por 7,5 min. </li><li> Ajustar a temperatura do detector espectrómetro de massa a 250 ° C e digitalizar a de 50 a 500 m / z no modo de impacto de electrões. NOTA: A ionização por impacto remove um único electrão resultando na formação de um catião radical que irá ser passada para a frente para análise de massa. Devido às altas ligações covalentes energia intramolar dentro domolécula quebra criando fragmentos de menor m / z. Estes fragmentos formar uma impressão digital específica para uma substância. </li><li> Injectar 1 ul da amostra. Detectar 1-heptadeceno após o tempo de retenção de 11,4 minutos por a impressão digital correspondente (Figura 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A geração de luz-driven de peróxido de hidrogênio pode ser aplicado para uma gama redox transformações, incluindo peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 e P450 monooxigenases 5. É uma abordagem fácil e praticável. No longo prazo, o uso de luz visível abre a perspectiva de se utilizar a luz solar para as transformações químicas, que é uma alternativa sustentável para reacções ricos em energia. O método é aplicável com enzima purificada ou com extracto isento de células. Enquanto o último requer menos trabalho e de custos, deve notar-se que pequenas moléculas no extracto em bruto pode interferir com a conversão de luz catalisada. Uma abordagem possível é para remover estes componentes pequenos com um microfiltrantes (isto é, por centrifugação numa unidade de filtração centrífuga ou por diálise). A concentração da molécula decolheita FMN determina a concentração do peróxido de hidrogénio. Dependendo da AffiniTy da oxidorredutase, esta concentração é decisiva para a actividade enzimática. Outro factor importante é a concentração do doador de electrões EDTA sacrificial. O parâmetro mais importante, no entanto, é a estabilidade operacional e a actividade da enzima. O olefinization de ácidos gordos é uma reacção elegante para a conversão dos ácidos gordos bio-baseados em olefinas que pertencem aos principais produtos para a indústria química. A descarboxilação biocatalítica-driven luz pode ser levada a cabo a temperatura ambiente e a um pH neutro, o que oferece vantagens evidentes em termos de sustentabilidade. Os nossos resultados mostram que a geração in situ de peróxido de hidrogénio é uma estratégia para fornecer o cofactor sem prejudicar a estabilidade da enzima, conduzindo a uma conversão elevada. Os métodos atuais para a regeneração cofator usar produtos agrícolas ou produtos químicos à base de gasolina. reações luz-driven estão surgindo como alternativa renovável. Futuroinvestigação será dedicada a métodos para a substituição do reagente EDTA sacrificial por moléculas mais baratos e para reduzir a quantidade de luz-colheita molécula FMN.

A mudança climática eo esgotamento previsível dos recursos renováveis ​​constitui uma ameaça grave para a nossa sociedade. Neste contexto, catálise enzimática representa um potencial ainda não plenamente exploradas para o desenvolvimento de sustentável e mais &quot;verde&quot; química 1. Oxidorredutases tem a capacidade de catalisar a introdução e a modificação de grupos funcionais sob condições de reacção suaves e pertencem às mais importantes biocatalisadores 2. A maioria das transformações redox requer o fornecimento de externa de co-factores, tais como o NAD (P) H. Métodos para a regeneração do cofactor foram aplicadas em escala industrial. No entanto, eles ainda resultar em elevados custos de processo, o que limita a sua aplicação principalmente para produtos de alto valor. Curiosamente, várias peroxidases 3,4 e P450 monooxigenases 5 aceitar electrões a partir de peróxido de hidrogénio por meio do assim chamado peróxido de derivação. Enquanto H 2 O 2 é um co-reagente mais barato, que é declaradamente inseUL para muitas enzimas. A constante formação in situ de baixas concentrações de peróxido de hidrogénio é uma abordagem viável para conduzir a reacção, sem prejudicar a estabilidade operacional da enzima. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figura 1. Experimental set-up do decarboxylation photobiocatalytic de ácidos graxos por OLET JE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> O uso da luz como fonte de energia para processos químicos e biológicos tem vindo a receber cada vez mais atenção nos últimos anos 6. Geração de luz dirigido de peróxido de hidrogénio tem surgido como um método fácil e robusto para fornecer peróxido de hidrogénio para transformações redox (Figura 1). Um fotocatalisador tais como flavina adenina seg.onucleotide (FMN) permite a redução de oxigénio molecular em peróxido de hidrogénio, o qual é então utilizado como co-factor para a reacção enzimática oxyfunctionalization. Os doadores de electrões possíveis são o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido ascórbico ou o formiato de baixo custo. O método é geralmente aplicável para a H 2 O 2 enzimas dependentes, incluindo as peroxidases 3,4 e P450 monooxigenases 5. Nós temos investigado recentemente a aplicação de um novo descarboxilase bacteriana 7 para a transformação de gorduras naturais em olefinas 8. Esta seria uma rota sustentável para a síntese de produtos químicos de plataformas amplamente utilizado a partir de uma fonte de base biológica. O descarboxilase OLET JE a partir da bactéria Jeotgalicoccus sp gram-positiva. catalisa a descarboxilação oxidativa de ácidos gordos e forma 1-alcenos como produtos. OLET JE está intimamente relacionado com monooxigenases P450 bacterianas e precisa de elétrons fperóxido de hidrogénio ROM para a reacção. Infelizmente, a adição de H 2 O 2 a uma solução de substrato e enzima resultou em conversões baixas e uma fraca reprodutibilidade dos resultados, presumivelmente devido a um efeito prejudicial de peróxido de hidrogénio sobre a estabilidade do OLET JE. Geração de uma proteína de fusão com a NADPH-reductase RhFred fez uma descarboxilação dependente de NADPH possível. 9 No entanto, o alto preço do NADPH e as actuais possibilidades limitadas de uma regeneração econômica nos levou a investigar doadores de elétrons mais baratos. Inspirado pela semelhança de OLET JE com monooxigenases P450, utilizou-se a geração de luz catalisada de H 2 O 2. Tivemos o prazer de obter altas conversões (até&gt; 95%), utilizando extratos de células livres ou soluções enzimáticas purificadas. Com o exemplo de descarboxilação de ácidos graxos, apresentamos um protocolo geral para enzym-driven luztransformações redox atic usando FMN como fotocatalisador e peróxido de hidrogênio como co-fator. Os métodos apresentados incluem a produção da enzima recombinante em células de E. coli, a purificação da enzima, a aplicação para a síntese de 1-alcenos e a análise dos produtos de reacção.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

Oxirredutases pertencem às enzimas industriais mais-aplicadas. No entanto, eles precisam de elétrons externos cujo fornecimento é muitas vezes caro e desafiador. Reciclagem do NADH ou NADPH doadores de electrões requer a utilização de outros enzimas e substratos sacrificiais. Curiosamente, vários Oxirredutases aceitar peróxido de hidrogénio como doador de elétrons. Apesar de ser pouco dispendioso, este reagente, muitas vezes reduz a estabilidade das enzimas. Uma solução para este problema é a geração in situ do cofactor. O fornecimento contínuo da co-factor, a baixa concentração conduz a reacção sem prejudicar a estabilidade da enzima. Este trabalho demonstra um método para a luz catalisada por geração in situ de peróxido de hidrogénio com o exemplo da descarboxilase de ácido gordo dependente do heme OLET JE. O descarboxilase do ácido graxo OLET JE foi descoberto devido à sua capacidade única de produzir de cadeia longa 1-alcenos de ácidos graxos, uma enzimática até então desconhecidoreação. 1-alcenos são aditivos amplamente utilizado para plastificantes e lubrificantes. OLET JE foi mostrado para aceitar electrões a partir de peróxido de hidrogénio para a descarboxilação oxidativa. Embora a adição de peróxido de hidrogênio danos a enzima e resulta em rendimentos baixos, a geração in situ do cofator contorna este problema. O sistema photobiocatalytic mostra vantagens claras sobre a actividade da enzima e o rendimento, o que resulta em um sistema simples e eficiente para a descarboxilação de ácido gordo.

Enquanto a adição de peróxido de hidrogénio à mistura de reacção resultou em conversões baixas (&lt;10%) a moderada, a geração in situ de peróxido de hidrogénio aumentou a conversão a uma conversão de 80%. Análise por CG / EM mostra a formação de olefinas a partir de ácidos gordos (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figura 2. (A) perfil de temperatura para GC medições / MS. (B) de impressão digital do eluição 1-heptadeceno após 11,4 min. (C) Característica íons C n H 2n-1 fragmento secundárias de olefinas terminais exemplar mostrado por 1-heptadeceno. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> E. coli. Uma solução de enzima purificada mostrou uma clara correlação entre a concentração de enzima e de conversão. O aumento da concentração do decolheita chumbo molécula FMN de conversões mais elevadas. No entanto, aumentar a concentração acima de 10 mM não acelerar ainda mais as reacções, o que indica que a quantidade de peróxido de hidrogénio é suficientemente disponível e já não o factor limitante. Além da descarboxilação de ácidos gordos, OLET JE também catalisa uma hidroxilação na posição-β. Na conversão do ácido esteárico, a descarboxilação é cerca de três vezes mais rápido do que a hidroxilação. Numa experiência típica usando uma solução de ácido esteárico 0,5 mM e 10 pM FMN, 99% do substrato foram convertidos a uma mistura de 1-heptadeceno e ácido 2-hidroxiesteárico, com um rácio de3,3: 1 (Figura 3) 8. Uma investigação do espectro do substrato da luz biocatálise-driven mostraram que para os ácidos gordos com cadeias acilo mais longas, OLET JE preferencialmente catalisa a descarboxilação, embora a quantidade relativa de ácidos gordos hidroxilo na mistura do produto aumentou com o comprimento de cadeia mais curta. Os ácidos graxos mais curtos do que o ácido mirístico (C14) não foram submetidos a descarboxilação. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figura 3. análise cromatográfica de gás de OLET JE mediada por descarboxilação de ácido esteárico (11,15 min) em 1-heptadeceno (8,4 min), ácido esteárico (12,04 min) ácido esteárico β-hidroxi α-hidroxi (12,1 min). A mudança das áreas dos picos de amostras colhidas ao longo de um tempo de curso de 2 horas é mostrado. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para vie</a>wa versão maior desta figura. Surpreendentemente, os ácidos insaturados de ácido oleico (C18: cis 1d9) e ácido linoleico (C18: 2d9d12) não foram aceites como substratos, o que indica que a configuração de entrançado de duplas ligações cis não podem ser acomodados num modo de ligação produtiva na enzima. A adição de ácido oleico (10%) também preveniu a conversão do ácido esteárico. Curiosamente, o ácido esteárico (C18: 1d9 trans) foi convertido por OLET JE, ainda com uma actividade ligeiramente inferior, em seguida, o ácido esteárico.

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Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Nós descrevemos um protocolo para a geração de luz catalisada de peróxido de hidrogênio - um co-fator para transformações oxidativas.

Claro conduzido enzimática descarboxilação

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Universidad de Cartagena UDEC

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Carboxylic Acids

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10.6K visualizações.  Ruhr Universität Bochum.  Nós descrevemos um protocolo para a geração de luz catalisada de peróxido de hidrogênio - um co-fator para transformações oxidativas. 

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A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Bioengenharia

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Bioquímica

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reações Enzimáticas em Cascata para a Síntese de Aminoálcoois Quirais a partir de L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Química

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expressão, purificação, cristalização e ensaios enzimáticos de proteínas contendo domínio de Fumarilacetoacetato de hidrolase

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biologia

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Imunologia e Infecção

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Detecção direta da Atividade Acetato de formação do Acetato Quinase Enzima

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

Perda de Grupo Carboxi como CO2: Descarboxilação de β-cetoácidos

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...