R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).

تنبيه: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه التوليفات هي شديدة السمية ومسرطنة. يجب أن تتم جميع الخطوات التي تنطوي على المذيبات العضوية الضارة، وخاصة استخراج منتجات التفاعل واشتقاق من الأحماض الدهنية تحت غطاء الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، والسراويل كامل طول والأحذية المغلقة اصبع القدم ). جميع العمليات التي تنطوي على الكائنات المعدلة وراثيا في هذا العمل تتطلب المنشآت التي تمت الموافقة عليها للتعامل مع الكائنات المعدلة وراثيا من S1 مستوى السلامة. 1. التعبير عن المؤتلف كربوكسيل OleT JE في E. القولونية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلالة إنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجينات الاصطناعية من OleT JE من Jeotgalicoccus والمستنسخة في ناقلات التعبير باسك-IBA37plus كما هو موضح 8 </sup&gt; ملاحظة: لتجنب تدهور الأحماض الدهنية من الانزيمات من عملية التمثيل الغذائي البكتيري، E. تم استخدام كولاي سلالة JW5020 من مجموعة كيو مع مسار مختلة لتدهور الأحماض الدهنية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة وتحريض التعبير عن الانزيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثقافة قبل، فحقن هاء القولونية JW5020 OleT متحولة من LB لوحة (تحتوي على 100 ​​ميكروغرام مل -1 الأمبيسلين) في اثنين من 3 مل LB المتوسطة في أنابيب الاختبار. ماصة الأمبيسلين (100 ميكروغرام مل -1) من محلول المخزون في المتوسط ​​لاختيار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الثقافات السابقة لمدة 200 مل LB المتوسطة، التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام مل -1)، في 1 قوارير L هزة. العائدات الحضانة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة التغيير في ل 600Nm OD بعد التلقيح. عندما OD 600 تصل قيمة بين 0.6 إلىد 0.8 لحث على التعبير عن طريق إضافة التتراسيكلين (0.2 ميكروغرام مل -1). احتضان الثقافات لمدة 15 ساعة على 20 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. ملاحظة: منذ OleT JE يحتوي على العامل المساعد الهيم، لا بد من إضافة حمض الليفولينيك δ الأمينية (0.5 ملم) قبل الحث على تقديم الثقافة مع تمهيدا لتخليق العامل المساعد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحلل الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات التالية على الجليد. نقل الثقافات التي كتبها الصب أو pipetting لفي أنابيب الطرد المركزي واستخدام مقياس لضمان التوزيع العادل. أجهزة الطرد المركزي الثقافات لمدة 20 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية تجاهل طاف و resuspend الكريات في 50 مل العازلة (تريس 50 مم، كلوريد الصوديوم 200 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) من قبل pipetting ونقل تعليق في أنبوب الطرد المركزي مخروطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4000 x ج في 4 درجات مئوية تجاهل طاف، resuspend كل بيليه في 3 مل العازلة من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تحلل الخلية التي كتبها sonicating الحلول على الجليد (ثلاث دورات × 30 ثانية) ترك وقفة 1 دقيقة في فترة ما بين الدورات. الطرد المركزي الحلول لمدة 20 دقيقة في 15000 x ج في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام خلية ونقل طاف في أنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل من دون إزعاج بيليه من قبل pipetting. تجاهل بيليه. ملاحظة: سيتم استخدام واحد جزء المذيبات مباشرة لbiocatalysis بعد إزالة جزيئات صغيرة. سيتم استخدام جزء ثان لتنقية OleT JE صاحب الموسومة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزيئات صغيرة من الخلايا مقتطفات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام استخراج النفط الخام في biocatalysis إزالة الجزيئات الصغيرة التي قد تتداخل مع تشكيل بيروكسيد الهيدروجين أو نقل الإلكترون من قبل pipetting 3 مل من مستخلص خالية من الخلايا في وحدة تصفية الطرد المركزي مع 10 غشاء كيلو دالتون وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج في 4 درجات مئوية. Resuspend والبروتين المتبقية في 3 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية OleT </stroنانوغرام&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 3 مل من استخراج الخلايا الثاني لصاحب بور ني NTA أعمدة الدوران، والتي تم معايرتها قبل العازلة مع موازنة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 10 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الأعمدة مع المقابس السفلية والعلوية المسمار قبعات ويهز لهم برفق حتى يتم توزيع الراتنج على قدم المساواة مع استخراج خالية من الخلايا. احتضان الأعمدة تحميل لمدة 30 دقيقة في شاكر النفقات العامة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأعمدة مع 1 مل من غسل العازلة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) بواسطة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 2 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأعمدة في أنبوب الطرد المركزي المخروطية الطازجة وإضافة 1 مل من شطف العازلة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 250 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) OleT JE. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 2 دقيقة وكرر هذه الخطوة مرتين. ملاحظة: سوف إيميدازول ربط النيكل، وبالتالي إزالة OleT JE من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شطف إلى وحدة تصفية الطرد المركزي (10 كيلو دالتون الفنزويليةالغشاء) وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج في 4 درجات مئوية لإزالة ايميدازول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق نقاء الانزيم من قبل SDS-الصفحة (15٪). 9 مزيج 3 ميكرولتر من شطف مع SDS العازلة (تركيز 1X النهائي)، واحتضان الحل في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتمسخ. تطبيق في وقت لاحق المبلغ الإجمالي على SDS-الصفحة. تشغيل هلام في 35 مللي أمبير باستخدام معيار البروتين التجاري. اكتشاف بروتين في 50 كيلو دالتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد تركيز البروتين يستخدم التجارية المتاحة BSA-عدة. ماصة 50 ميكرولتر من عينات البروتين المخفف (1: 100، 1: 200، 1: 500) ومستوى BSA (0، 20، 30، 40،50، 60، 80، 100 ملغ مل -1) في لوحة 96-جيدا . إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد الكاشف، قياس الامتصاصية في 595 نانومتر بعد 15 دقيقة مع مقياس التألق وحساب تركيزات باستخدام المنحنى القياسي. </li></ol></li></ol> 2. التحول الأحيائي الضوء المحفز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردود الفعل Biocatalytic دون إضافة بيروكسيد الهيدروجين<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 10 مل الأسهم من 10 ملي حمض دهني (M ص 284.5 غرام مول -1) وذلك بإضافة 10٪ (ت / ت) tergitol و0.0284 غرام حامض دهني إلى الماء المقطر. الحرارة الحل في غرفة التدفئة إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب الأحماض الدهنية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biocatalysis وأخذ العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اثنين 2 مل مخاليط رد فعل تحتوي على 50 ملي EDTA، 0.01 ملي FMN، 0.5 ملي حمض دهني في تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة. إضافة شريط التحريك المغناطيسي لتوفير ما يكفي من الأوكسجين ووضع أنابيب الزجاج في حمام مائي، تسخينها إلى درجة حرارة 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكروغرام مل -1 انزيم المنقى أو 10٪ (ت / ت) استخراج خالية من الخلايا لكل من خليط التفاعل وتضيء لهم لمبة ضوء الزجاج واضحة (120 W) في 15 سم المسافة بين أنابيب رد فعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ 200 عينة ميكرولتر في نقطة زمنية محددة (0، 10، 30، 60، و 120 دقيقة، وأكثر من ليلة) وقف رد الفعل مع 20 ميكرولتر 37٪ حمض الهيدروكلوريك. إضافة 5 ميكرولتر حمض الميريستيك (10 ملي الأسهم حتىlution) وفقا لمعايير الداخلي. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المنتجات رد فعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج إضافة 500 ميكرولتر خلات الإيثيل للعينات مرتين، عكس الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع 400 ميكرولتر من طاف والسماح للمذيب تتبخر تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatize الأحماض الكربوكسيلية إلى حمض trimethylsilylcarboxylic بإضافة 200 ميكرولتر N السلفون N - (trimethylsilyl) trifluoro اسيتاميد (MSTFA). احتضان الحل عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من أجل تحويل مجموعات الهيدروكسيل إلى trimethylsilyl الاسترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقرير من التحويل عن طريق GC / ااا ملاحظة: تحديد تشكيل 1-heptadecene (RT: 8.34 دقيقة)، حامض دهني ألفا و-β هيدروكسي (RT: 12.05 و 12.1 دقيقة) وانخفاض الركيزة (RT: 11.15 دقيقة) باستخدام GC / ااا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الوضع في درجة الحرارة هو موضح أدناه مجموعة من درجة حرارة الحقن إلى 340 درجة مئوية. عقددرجة حرارة الفرن الأولية في 90 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة، وبعد ذلك مع زيادة 45 ° C دقيقة -1. في 220 درجة مئوية، مع الاستمرار على درجة الحرارة لمدة 2 دقيقة. بعد زيادة المتكررة من 45 درجة مئوية دقيقة -1، مع الاستمرار على درجة حرارة 280 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم زيادة مع 60 ° C دقيقة -1. ملاحظة: درجة الحرارة القصوى 330 درجة مئوية يقام لل1،44 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 4 ميكرولتر من العينة، مع نسبة الانقسام من 5 للحصول على التطاير السريع وخلط متجانس مع الهيليوم الغاز الناقل. ملاحظة: في الاعتماد على درجات الحرارة وزيادة الركيزة ومنتجات سيدخل مرحلة الغاز. تم الكشف عن المواد التي GC / ااا كاشف بعد اجتياز عمود في بعض الأحيان الاحتفاظ محددة ويتم عرضها كما القمم التي تظهر على الشاشة. مراقبة تشكيل الذروة على الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز المنتج يتكون من الصيغة التالية: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; ملاحظة: تم تحديد عامل المعايرة خصيصا لهذا العمود لكل الركيزة والمنتج عن طريق حساب منحنى قياسي من كميات معروفة من المواد derivatized ومنطقة ذروة المقابلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القمم حمض أولفين وβ هيدروكسي بواسطة GC / MS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القمم حمض أولفين وβ هيدروكسي بواسطة GC / MS. ضبط الوضع في درجة الحرارة. ضبط درجة الحرارة حقن إلى 250 درجة مئوية. عقد درجة حرارة الفرن إلى 100 ​​درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبعد ذلك زيادة مع 20 ° C دقيقة -1. يقام الحد الأقصى لدرجة الحرارة لمدة 7.5 دقيقة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الجماعية درجة الحرارة مطياف كاشف إلى 250 درجة مئوية، ومسح على 50 إلى 500 م / ض في وضع تأثير الإلكترون. ملاحظة: الكترون تأثير التأين يزيل الكترون واحد مما أدى إلى تشكيل الموجبة الراديكالية التي سيتم تمريرها إلى الأمام للتحليل الشامل. نظرا لروابط تساهمية الطاقة intramolar عالية داخلكسر جزيء خلق شظايا أقل م / ض. هذه الشظايا تشكل بصمة محددة للمادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 1 ميكرولتر من العينة. كشف 1-Heptadecene بعد 11.4 دقيقة الوقت الاحتفاظ من قبل بصمة المقابلة (الشكل 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kourist, R., Dom&#236;nguez de Mar&#236;a, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments.">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li><li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taming+of+oxygen:+biocatalytic+oxyfunctionalisations.">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li><li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions.">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li><li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis:+Nonconventional+Regeneration+Methods.">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li><li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases.">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li><li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts.">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).</li><li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+olefin+(1-alkene)+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species.">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li><li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis.">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-independent+production+of+&#945;-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase.">Hydrogen peroxide-independent production of &#945;-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).</li><li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions.">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الجيل مدفوعة خفيفة من بيروكسيد الهيدروجين يمكن تطبيقها لتحولات نطاق الأكسدة، بما في ذلك peroxygenases 3، chloroperoxidases 10 و P450 monooxygenases 5. وهو نهج سهل وعملي. وعلى المدى الطويل، واستخدام الضوء المرئي يفتح منظور للاستفادة من أشعة الشمس لمدة التحولات الكيميائية، وهو بديل مستدام لردود الفعل الغنية بالطاقة. والطريقة تنطبق مع انزيم النقي أو مع استخراج خالية من الخلايا. في حين أن هذا الأخير يتطلب أقل تكلفة والعمل، وتجدر الإشارة إلى أن الجزيئات الصغيرة في استخراج النفط الخام قد تتداخل مع تحويل ضوء المحفز. نهج عملي لإزالة هذه المكونات الصغيرة مع micromembrane (أي عن طريق الطرد المركزي في وحدة تصفية الطرد المركزي أو عن طريق غسيل الكلى). تركيز جزيء ضوء حصاد FMN يحدد تركيز بيروكسيد الهيدروجين. اعتمادا على AFFINIتاي من مؤكسدة مختزلة، وهذا التركيز هو الحاسم في النشاط الأنزيمي. عامل آخر مهم هو تركيز الذبيحه EDTA المانحة الإلكترون. المعلمة الأكثر أهمية، ومع ذلك، هو الاستقرار التشغيلي ونشاط الإنزيم. وolefinization من الأحماض الدهنية غير رد فعل أنيقة لتحويل الأحماض الدهنية الحيوية ومقرها في الأوليفينات التي تنتمي إلى السلع الرئيسية للصناعات الكيماوية. يمكن أن يتم biocatalytic نزع الكربوكسيل يحركها الضوء في درجة حرارة الغرفة وفي محايد الرقم الهيدروجيني، والذي يوفر مزايا واضحة من حيث الاستدامة. وتشير النتائج التي توصلنا إليها في الجيل الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين هو استراتيجية لتزويد العامل المساعد دون المساس الاستقرار الإنزيم، مما أدى إلى تحويل عالية. الأساليب الحالية لتجديد العامل المساعد استخدام المنتجات الزراعية أو المواد الكيميائية القائمة على البنزين. ردود الفعل يقودها ضوء آخذة في الظهور كبديل المتجددة. مستقبلسيخصص الأبحاث إلى طرق لإحلال EDTA كاشف الأضاحي من قبل جزيئات أرخص ولتقليل كمية من جزيء FMN ضوء حصاد.

تغير المناخ واستنزاف المنظور من الموارد المتجددة يشكل تهديدا خطيرا لمجتمعنا. في هذا السياق، يمثل انزيم الحفز إمكانية تزال غير مستغلة بالكامل لتنمية مستدامة و&#39;خضرة&#39; الكيمياء 1. إنزيم أكسدة-اختزال لديها القدرة على تحفيز إدخال وتعديل المجموعات الوظيفية في ظل ظروف ردود الفعل خفيفة وتنتمي إلى البيولوجية الحفازة أهم 2. تتطلب معظم التحولات الأكسدة توريد الخارجية من العوامل المساعدة مثل NAD (P) H. طبقت أساليب لتجديد العامل المساعد في نطاق صناعي. ومع ذلك، فإنها لا تزال تؤدي إلى تكاليف عملية عالية، مما يحد من تطبيقها في معظمها إلى منتجات عالية القيمة. ومن المثير للاهتمام، والعديد من مستخلصات 3،4 وmonooxygenases P450 5 تقبل الإلكترونات من بيروكسيد الهيدروجين عن طريق ما يسمى تحويلة بيروكسيد. بينما H 2 O 2 هي رخيصة المشارك كاشف، فإنه يقال harmfالمجاهدين للعديد من الإنزيمات. وثابت في تشكيل الموقعي تركيزات منخفضة من بيروكسيد الهيدروجين هو نهج عملي لحملة رد الفعل دون أن ينال من الاستقرار التشغيلي للإنزيم. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> الشكل 1. التجريبية مجموعة المتابعة لنزع الكربوكسيل photobiocatalytic من الأحماض الدهنية التي كتبها OleT JE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> استخدام الضوء كمصدر للطاقة لعمليات كيميائية وبيولوجية تم باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة 6. وقد برز جيل ضوء يحركها من بيروكسيد الهيدروجين باعتباره طريقة سهلة وقوية لتزويد بيروكسيد الهيدروجين لتحولات الأكسدة (الشكل 1). وضوئي مثل فلافين الأدينين مونonucleotide (FMN) يسمح للالحد من الأوكسجين الجزيئي لبيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم بعد ذلك استخدام العامل المساعد للتفاعل الإنزيمي oxyfunctionalization. الجهات المانحة الإلكترون الممكنة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، أسكوربات أو formiate غير مكلفة. طريقة قابلة للتطبيق بشكل عام لH 2 O 2 الانزيمات معتمد على، بما في ذلك مستخلصات 3،4 وmonooxygenases P450 5. لقد حققت مؤخرا تطبيق كربوكسيل البكتيرية رواية (7) لتحويل الدهون الطبيعية في الأوليفينات 8. وهذا سيكون طريقا المستدام لتركيب المواد الكيميائية منصة تستخدم على نطاق واسع من مصدر الحيوي القائم. وكربوكسيل OleT JE من البكتيريا Jeotgalicoccus س إيجابية الجرام. يحفز نزع الكربوكسيل التأكسدي من الأحماض الدهنية ويشكل 1-الألكينات عن المنتجات. يرتبط OleT JE ارتباطا وثيقا monooxygenases P450 البكتيرية ويحتاج الإلكترونات ومدمج بيروكسيد الهيدروجين للتفاعل. للأسف، أدت إضافة H 2 O 2 إلى حل الركيزة والانزيم في التحويلات منخفضة واستنساخ سوء النتائج، ويفترض بسبب تأثير ضار من بيروكسيد الهيدروجين على استقرار OleT JE. جيل من البروتين الانصهار مع NADPH اختزال RhFred إجراء نزع الكربوكسيل تعتمد على NADPH ممكن. 9 ومع ذلك، فإن ارتفاع أسعار NADPH والإمكانيات المحدودة الحالية لتجديد فعالة من حيث التكلفة دفعنا للتحقيق المانحين الإلكترون أرخص. مستوحاة من تشابه OleT JE مع monooxygenases P450، كنا الجيل المحفزة خفيفة من H 2 O 2. كنا سعداء للحصول على تحويلات عالية (تصل إلى&gt; 95٪) باستخدام مقتطفات خالية من الخلايا أو حلول الانزيم النقاء. مع المثال من الأحماض الدهنية نزع الكربوكسيل، نقدم بروتوكول عام لانزيمات يحركها الضوءآتيك الأكسدة التحولات باستخدام FMN كما ضوئي والهيدروجين بيروكسيد كما العامل المساعد. وتشمل طرق عرض إنتاج الإنزيم في الخلية المؤتلف من E. القولونية، وتنقية للانزيم، وتطبيق لتركيب 1-الألكينات وتحليل نواتج التفاعل.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&amp;reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatic decarboxylation

إنزيم أكسدة-اختزال تنتمي إلى الانزيمات الصناعية الأكثر تطبيقها. ومع ذلك، فإنها تحتاج الإلكترونات الخارجية التي إمدادات غالبا ما تكون مكلفة وصعبة. إعادة تدوير NADH الجهات المانحة الإلكترون أو NADPH يتطلب استخدام الانزيمات إضافية وركائز فداء. ومن المثير للاهتمام، عدة إنزيم أكسدة-اختزال تقبل بيروكسيد الهيدروجين متبرع الإلكترون. في حين يجري غير مكلفة، وهذا كاشف غالبا ما يقلل من الاستقرار من الإنزيمات. والحل لهذه المشكلة هو الجيل الموقع من العامل المساعد في. على امدادات مستمرة من العامل المساعد في تركيز منخفض يدفع رد الفعل دون المساس الاستقرار الانزيم. توضح هذه الورقة طريقة لضوء المحفز في مجال توليد الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين مع مثال كربوكسيل الأحماض الدهنية التي تعتمد على الهيم OleT JE. تم اكتشاف الأحماض الدهنية كربوكسيل OleT JE بسبب قدرتها الفريدة على إنتاج سلسلة طويلة-1-الألكينات من الأحماض الدهنية، والأنزيمية غير معروف حتى الآنرد فعل. وتستخدم على نطاق واسع 1-الألكينات المضافة لصناعة المواد البلاستيكية ومواد التشحيم. وقد تبين OleT JE لقبول الإلكترونات من بيروكسيد الهيدروجين لنزع الكربوكسيل التأكسدي. بينما إضافة الهيدروجين بيروكسيد الأضرار الانزيم والنتائج في العائدات المنخفضة، في جيل الموقع من العامل المساعد تلتف هذه المشكلة. ويبين النظام photobiocatalytic مزايا واضحة بشأن نشاط انزيم والعائد، مما أدى إلى نظام بسيط وفعال لنزع الكربوكسيل الأحماض الدهنية.

<html> في حين أدت إضافة بيروكسيد الهيدروجين لخليط التفاعل في منخفض إلى متوسط ​​التحويلات (&lt;10٪)، في جيل الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين زيادة تحويل ما يصل الى تحويل 80٪. تحليل من قبل GC / MS يظهر تشكيل الأوليفينات من الأحماض الدهنية (الشكل 2). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> الشكل 2. (أ) لمحة درجة الحرارة لقياس GC / MS. (ب) بصمة ليبلغ حجمه 1-heptadecene بعد 11.4 دقيقة. (C) المميزة الثانوية أيونات C ن H 2N-1 جزء من الأوليفينات محطة نموذجية تعرض ل1-heptadecene. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> -together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; إن رد الفعل المحفز خفيفة تحقيق التحويلات عالية مع مقتطفات خالية من الخلايا من E. القولونية. وأظهر حل انزيم المنقى وجود علاقة واضحة بين تركيز الانزيم والتحويل. زيادة تركيز ضوء حصاد جزيء FMN تؤدي إلى تحويلات أعلى. ومع ذلك، زيادة تركيز أعلى من 10 ملي لا زيادة تسريع وتيرة ردود الفعل، مشيرا إلى أن كمية بيروكسيد الهيدروجين متاح بما فيه الكفاية وأنه لم يعد العامل المحدد. وبالإضافة إلى نزع الكربوكسيل من الأحماض الدهنية، OleT JE أيضا يحفز على الهيدروكسيل في β-الموقف. في تحويل حامض دهني، ونزع الكربوكسيل حوالي ثلاث مرات أسرع من الهيدروكسيل. في تجربة نموذجية باستخدام محلول من 0.5 ملي حمض دهني و 10 ميكرومتر FMN، تم تحويل 99٪ من الركيزة إلى خليط من 1 heptadecene وحمض 2-hydroxystearic مع نسبة3.3: 1 (الشكل 3) 8. وأظهر التحقيق من الطيف الركيزة للbiocatalysis يقودها ضوء أن للأحماض الدهنية مع سلاسل أسيل أطول، OleT JE يحفز تفضيلي نزع الكربوكسيل، في حين زادت كمية النسبي للأحماض الدهنية الهيدروكسيل في خليط المنتجات مع أقصر طول السلسلة. لم الأحماض الدهنية أقصر من حمض الميريستيك (C14) لا تخضع لنزع الكربوكسيل. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> الشكل 3. الغاز التحليل الكروماتوغرافي من OleT JE بوساطة نزع الكربوكسيل من حمض دهني (11.15 دقيقة) إلى 1-heptadecene (8.4 دقيقة)،-α هيدروكسي حمض دهني (12.04 دقيقة)، β هيدروكسي حمض دهني (12.1 دقيقة). ويظهر التغير في المناطق الذروة من العينات التي أخذت أكثر من الوقت طبعا من 2 ساعة. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا للتنافس</a>وا نسخة أكبر من هذا الرقم. والمثير للدهشة، والأحماض غير المشبعة حمض الأوليك (C18: 1d9 رابطة الدول المستقلة) وحمض اللينوليك (C18: 2d9d12) لم تقبل بمثابة ركائز، مشيرا إلى أن التكوين الملتوية روابط مزدوجة رابطة الدول المستقلة لا يمكن استيعابها في وضع ملزم منتجة في الانزيم. إضافة حمض الأوليك (10٪) أيضا منع تحويل حمض دهني. ومن المثير للاهتمام، حامض دهني: تم تحويل (C18 1d9 العابرة) من خلال OleT JE، ولكن مع انخفاض النشاط قليلا ثم حامض دهني.

Watch this Scientific Journal Video about Light-driven Enzymatic Decarboxylation at JoVE.com

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

نحن تصف بروتوكول للجيل المحفزة خفيفة من بيروكسيد الهيدروجين - عامل مساعد للتحولات الأكسدة.

مدفوعة خفيفة الأنزيمية نزع الكربوكسيل

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Carboxylic Acids

SCIENTISTS IN ACTION

10.6K Views.  Ruhr Universität Bochum.  نحن تصف بروتوكول للجيل المحفزة خفيفة من بيروكسيد الهيدروجين - عامل مساعد للتحولات الأكسدة. 

Video: Light-driven Enzymatic Decarboxylation

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

مجموعة أدوات لتمكين تحويل المواد الهيدروكربونية في البيئات المائية

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Bioengineering

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biochemistry

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

تتالي الانزيمية ردود لتوليف الكحوليات الأمينية مراوان L-يسين

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biology

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells are enzymes and their activity is heavily regulated at many levels, including the transcriptional, mRNA stability, translational, post-translational and functional level. This complex regulation means that conventional quantitative or imaging assays, such as quantitative mRNA experiments, Western Blots and immunohistochemistry, yield incomplete information regarding the ultimate activity of enzymes, their function and/or their subcellular localization. Quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry (i.e., metabolic mapping) show in-depth information on in situ enzymatic activity and its kinetics, function and subcellular localization in an almost true-to-nature situation.
We describe a protocol to detect the activity of dehydrogenases, which are enzymes that perform redox reactions to reduce cofactors such as NAD(P)+ and FAD. Cells and tissue sections are incubated in a medium that is specific for the enzymatic activity of one dehydrogenase. Subsequently, the dehydrogenase that is the subject of investigation performs its enzymatic activity in its subcellular site. In a chemical reaction with the reaction medium, this ultimately generates blue-colored formazan at the site of the dehydrogenase&#39;s activity. The formazan&#39;s absorbance is therefore a direct measure of the dehydrogenase&#39;s activity and can be quantified using monochromatic light microscopy and image analysis. The quantitative aspect of this protocol enables researchers to draw statistical conclusions from these assays.
Besides observational studies, this technique can be used for inhibition studies of specific enzymes. In this context, studies benefit from the true-to-nature advantages of metabolic mapping, giving in situ results that may be physiologically more relevant than in vitro enzyme inhibition studies. In all, metabolic mapping is an indispensable technique to study metabolism at the cellular or tissue level. The technique is easy to adopt, provides in-depth, comprehensive and integrated metabolic information and enables rapid quantitative analysis.

Here, we present a protocol that can be used to microscopically visualize and quantify activity of dehydrogenases in cells and tissues and its kinetics, function and subcellular localization.

الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Immunology and Infection

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, overburdening a microorganism with genetic modifications can reduce host fitness and productivity. This problem can be overcome by using dynamic control: inducible expression of enzymes and pathways, typically using chemical- or nutrient-based additives, to balance cellular growth and production. Optogenetics offers a non-invasive, highly tunable, and reversible method of dynamically regulating gene expression. Here, we describe how to set up light-controlled fermentations of engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae for the production of chemicals or recombinant proteins. We discuss how to apply light at selected times and dosages to decouple microbial growth and production for improved fermentation control and productivity, as well as the key optimization considerations for best results. Additionally, we describe how to implement light controls for lab-scale bioreactor experiments. These protocols facilitate the adoption of optogenetic controls in engineered microorganisms for improved fermentation performance.

Optogenetic control of microbial metabolism offers flexible dynamic control over fermentation processes. The protocol here shows how to set up blue light-regulated fermentations for chemical and protein production at different volumetric scales.

التخمير الذي يتم التحكم فيه بالضوء لإنتاج المواد الكيميائية والبروتين الميكروبي

Microbial cell factories offer a sustainable alternative for producing chemicals and recombinant proteins from renewable feedstocks. However, ...

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &beta;-Ketoacids

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation easily. However, a silver salt of carboxylic acid&#160;reacts with bromine or iodine under high temperature to release carbon dioxide gas and forms halide&#160;with one less carbon. This reaction is called the Hunsdiecker reaction.
<img alt="Figure1" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 55px;" />
Unlike monocarboxylic acids, &#42933;-keto acids bearing a keto group at the &#946; position to the carboxyl group, readily undergo decarboxylation under an acid medium to form a ketone and releases carbon dioxide gas.
<img alt="Figure2" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 60px;" />
Decarboxylation reaction is biologically relevant while oxidizing food materials in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. In this cycle, oxalosuccinic acid is formed as an intermediate that bears three carboxyl groups and one carbonyl group. However, as the carbonyl group is at the &#42933;-position to only one carboxyl group, only one of the three carboxyl groups undergoes decarboxylation to produce &#945;-ketoglutaric acid by losing CO2.
<img alt="Figure3" src="/files/ftp_upload/12352/12352_PT_Figure_3.svg" style="text-align: center; height: 128px;" />

Loss of Carboxy Group as CO2: Decarboxylation of &amp;#946;-Ketoacids

فقدان مجموعة الكربوكسي كثاني أكسيدالكربون 2: نزع الكربوكسيل من β-الأحماض الكيتونية

Carboxylic acids, upon heating, undergo a decarboxylation reaction by releasing carbon dioxide gas. Monocarboxylic acids do not undergo decarboxylation ...