Este trabalho é apoiado pelo Projeto KAIST-financiado K-Vale VERMELHO &amp; B para 2014 eo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional da Coreia Research (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Atenção: Consulte as folhas de dados de segurança de materiais (MSDS) antes do uso de acetona e clorofórmio que são cancerígenos. 1. Preparação de Phospholipid Monolayer a uma água-Air Interface Plano <ol><li> Formação de uma monocamada de fosfolípidos <ol><li> Preparação de uma solução de fosfolípido <ol><li> Limpe um frasco de 4 ml com uma tampa revestida de politetrafluoretileno utilizando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes, e soprar azoto gasoso cuidadosamente para dentro do frasco para se livrar de água. </li><li> Dissolve-se 1 mg de fosfolípido (por exemplo, dioleoilfosfatidilcolina, DOPC) e 1 ml de clorofórmio no frasco para obter 1 mg / ml de concentração. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. Use concentrações mais baixas ou mais altas de solução de fosfolípido, se necessário. </li><li> Adicionar corante etiquetado fosfolípidos (por exemplo, rodamina dipalmitoilfosfatidiletanolamina, DPPE Rodamina) com menos de 1 mol% de fosfolípido de Solução, a fim de visualizar a monocamada de fosfolípido com um microscópio de fluorescência. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. </li><li> Envolver o frasco com uma fita de politetrafluoretileno para evitar a evaporação do solvente, e armazenar a amostra num congelador a -20 ° C. </li></ol></li><li> Deposição de fosfolipídios na interface ar-água <ol><li> Limpar uma placa de Petri (55 mm de diâmetro e 12 mm de altura) com etanol, e água desionizada, pelo menos, três vezes. </li><li> Encher a placa de Petri com 10 ml de água desionizada para criar uma interface ar-água. </li><li> Espalhe alguns microlitros da solução de fosfolípido com uma micro-seringa para uma interface limpa para atingir a pressão de superfície desejada e espere durante pelo menos 30 minutos para evaporar o solvente completamente, antes de fazer a experiência. Nota: Uma calha de Langmuir pode ser utilizado em vez de uma placa de Petri, se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície. </li></ol></li></ol></li><li> Sumedição de pressão rface <ol><li> Medir a pressão superficial da monocamada de fosfolípido com uma placa de Wilhelmy tensiómetro. Espera durante pelo menos 30 minutos para obter o papel de filtro humedecido suficiente se o papel de filtro é usado como uma placa de Wilhelmy. O protocolo detalhado está disponível em Kuhn et al. 20. </li><li> Ajustar a quantidade depositada do fosfolípido para controlar a pressão de superfície precisamente. Adicionar 4 ml da solução de DOPC (1 mg / ml) para a 30.25 cm 2 -Área da interface se ~ 5 mN / m de superfície de pressão é necessário. Nota: Se o papel de filtro não é completamente molhado, a pressão de superfície muda dramaticamente durante os primeiros 30 minutos da experiência, devido à mudança de peso do papel de filtro. </li></ol></li><li> Minimização do fluxo convectivo da monocamada <ol><li> Usar um aparelho em forma de cone que contém um reservatório de 3 mm com dois canais finos, ligado a uma grande parte da placa de Petri, para suprimir o fluxo convectivo dea monocamada, que pode perturbar o imaging morfologia e medição de pressão de superfície. </li><li> Certifique-se de combinar os níveis de água entre o interior eo exterior do aparelho de cone-forma para garantir que fosfolipídios circular livremente em toda a região antes de depositar fosfolipídios na interface ar-água. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Fosf monocamada na superfície curva de uma gotícula <ol><li> Processo afinando de um capilar de vidro usando micropipeta extrator <ol><li> Coloque um capilar de vidro (1 mm OD, ID de 0,78 mm, comprimento 100 mm) sobre um suporte de capilar de um puxador de micropipeta. </li><li> Projetar um programa para puxar os capilares com os valores dos parâmetros apropriados (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 e de pressão 200) e puxe os capilares com o programa projetado de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: Um capilar acabar com alguns micrômetros de diâmetro é necessário para formar uma gota de 100 um-por Applying com uma pressão de 10 kPa ~. Se a extremidade da ponta do capilar é muito pequena, muito mais elevada pressão,&gt; 600 kPa, é necessário para obter a gota, ao mesmo tempo que é difícil controlar o tamanho das gotículas com uma muito grande extremidade da ponta capilar. </li></ol></li><li> Absorção de fosfolípidos na superfície da gotícula Nota: Para formar uma monocamada de fosfolípidos na interface curvo de uma gota, uma solução de fosfolípido, sem corante fosfolípidos com etiquetas é usado para se obter um contraste de intensidade, contra a monocamada plana, preparada por procedimento 1. Além disso, ambos os processos 2.2.1 e 2.2 .2 são permitidas aqui. Se é necessário um controlo preciso da pressão de superfície à superfície da gotícula, 2.2.2 procedimento é altamente recomendável. No entanto, se não, o procedimento 2.2.1, que é uma forma muito mais fácil do que o procedimento 2.2.2, é útil. <ol><li> Processo de fosfolípidos revestimento a uma extremidade da ponta <ol><li> Limpe a lâmina de vidro usando acetona, etanol e água deionizada, pelo menos, três vezes. </li><li> Place o capilar cônico em uma lâmina de vidro limpa, e incline o capilar para facilitar a tocar a lâmina de vidro com uma extremidade de ponta. </li><li> Deixar cair algumas gotas de solução de fosfolípido (1 mg / ml) para a extremidade de ponta de um capilar que é aderida à lâmina de vidro usando uma seringa de vidro, e esperar, pelo menos, 30 minutos para evaporar o solvente completamente. Nota: É altamente recomendável para aderir a extremidade da ponta do capilar para a lâmina de vidro durante o processo 2.2.1.3 porque o perímetro da extremidade da ponta é demasiado pequeno para conter a gota dos fosfolípidos na extremidade da ponta apenas por força de capilaridade. </li></ol></li><li> Preparação de uma solução de vesículas <ol><li> Limpe um frasco, e remover a água do frasco, tal como foi introduzido no processo 1.1.1.1. </li><li> Seca-se num volume de 2 ml de solução de fosfolípido (1 mg / ml) através da aplicação de gás de azoto suavemente, e desidratar o frasco durante 1 h à TA para eliminar qualquer solvente remanescente. Executar este procedimento em um exaustor para a segurança. </li><li> Adicionar 2ml de água desionizada num frasco para injectáveis ​​contendo lípidos secos, e incuba-se o frasco num forno a 60 ° C durante 1 h. </li><li> Agitar o frasco várias vezes, e sonicate (HF-frequência: até 40 kHz, potência: 370 W) por 30 min para obter vesículas. </li><li> Executar processos de extrusão e de congelamento e descongelamento para obter vesículas unilamelares monodispersas. O protocolo detalhado para a preparação de vesículas é descrito em Mayer et al. 21. Nota: pressão de superfície da interface de gotículas é controlado com precisão ajustando-se o tempo de espera após a formação da gotícula que contém vesículas unilamelares monodispersas. Usando um método de gota pendente 22, é necessário medir a variação de pressão de superfície em função do tempo, antes de fazer a experiência. </li></ol></li></ol></li><li> Formação de uma gota que contém uma monocamada de fosfolípidos na superfície curva <ol><li> Preencha o capilar afilado com 10 ml de água deionizada de Procedure 2.2.1. Em alternativa, utilizar 10 ml da solução de vesículas a partir de procedimento 2.2.2. </li><li> Ligue o capilar para um micro-injector automatizado para proporcionar a pressão para formar a gota. </li><li> Montar o capilar que está ligado a um micro-injector a um micromanipulador para controlar a posição do capilar precisamente. </li><li> Prepare um microscópio de campo brilhante (Microscópio 1, lente objetiva: 10X NA 0,3) para geração de imagens a vista lateral do capilar com uma câmera CCD. Microscópio 1 permite, assim, para observar a posição precisa da gotícula ao longo do eixo z e estimar o tamanho da gotícula. </li><li> Mover a extremidade da ponta para uma posição onde a vista lateral da extremidade da ponta é bem visualizado por microscópio 1 utilizando um micromanipulador, e aplicar uma pressão variável (~ 100 hPa) com a extremidade da ponta do capilar, até um tamanho apropriado (~ 100 um de diâmetro) de gotícula é formado. Nota: Recomenda-se que micro-injector e micromanipulador automatizada ser usod, se é necessário um bom controle do tamanho das gotas e localização da gota. Também é possível utilizar os manuais. </li></ol></li></ol> 3. imagens de fluorescência de Recuperação Após a fusão da gota Nota: Os princípios fundamentais deste protocolo são idênticos aos da técnica FRAP, excepto para o processo de coalescência gota. O Protocolo e afins teorias detalhadas de FRAP estão disponíveis em A. Lopez et al. 15 e D. Axelrod et al. 16. <ol><li> Monitorizar e controlar a localização da gotícula <ol><li> Preparar um microscópio invertido definido (Microscópio 2, lente objectiva: 10X NA 0,3, lente do tubo: distância focal 17 de cm) que permite tanto um microscópio de fluorescência com um conjunto de filtro adequado para Rodamina-DPPEs (excitação a 560 nm, emissão a 583 nm) e um microscópio de campo brilhante. Use uma câmera CCD aqui para visualizar os melhores vistas da gotícula com um microscópio de fluorescência mode e um modo de microscópio de campo brilhante. </li><li> Mover a gota revestido com um fosfolípido para uma interface ar-água plana ao longo do eixo Z, mas não se fundem a gota, no entanto, utilizando o micromanipulador. Use Microscópio 1 para visualizar a vista lateral da gota. </li><li> Localizar a gota no centro da vista de topo da monocamada plana, utilizando o micromanipulador. Use o modo de microscópio de campo brilhante de Microscópio 2 para visualizar visão de cima de monocamada plana. </li></ol></li><li> Mesclando a gota na interface ar-água plana <ol><li> Mover a gota ainda mais para a interface plana até que a gota se funde na interface, utilizando o micromanipulador. Se o processo de fusão é feita com sucesso, uma região escura com uma forma circular, que está rodeado por um fundo branco, observa-se fluorescência utilizando o modo de microscópio 2. </li><li> Gravar a série de imagens fluorescentes de acordo com o tempo após a fusão a gota, utilizando o modo de fluorescência de micros2. Use enfrentar uma taxa de quadros mais rápido do que a escala de tempo de difusão da monocamada aqui. Em DOPC monocamada, que leva alguns minutos para difundir para a área escura 200 um completamente. </li></ol></li></ol> 4. Determinar o coeficiente de difusão por Análise de Imagem Nota: Para determinar o coeficiente de difusão a partir de uma série de imagens, programa personalizado para análise de imagem é construído como descrito abaixo. Um código fonte detalhada deste programa está disponível no site Jove. <ol><li> A detecção de uma região circular de interesse <ol><li> Detecção do centro da região de interesse <ol><li> Obter uma série de imagens fluorescentes que foram gravados durante um processo de recuperação que contém uma área circular escuro e um fundo branco, e definir a primeira imagem da série como uma imagem de referência. Aqui, R D é o raio da área escura de uma imagem de referência em. </li><li> Convolute a imagem de referência com um círculo branco queSE intensidade é uniforme ao longo de toda uma região. Use função incorporada com o nome &#39;conv2&#39; para convolution como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 124. Aqui, o raio do círculo branco é ligeiramente menor do que R D. </li><li> Encontrar uma posição que indica um valor mínimo no cálculo de convolução, e definir esta posição como o centro da região de interesse na imagem de referência. </li></ol></li><li> Determinação de um raio da região de interesse <ol><li> Convolute a imagem de referência com um círculo branco que contém uma posição central, determinada por um procedimento de 4,1 e intensidade uniforme ao longo de toda uma região. Aqui, R S é o raio do círculo branco. Use iteração como &#39;para&#39; ou &#39;enquanto&#39; com a equação de um círculo para fazer o círculo branco, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 102-109. </li><li> Convolute a imagem de referência com outro círculo branco que tem um poucoraio maior (5% -10%), L R, a R S. Usar o mesmo método com o procedimento 4.1.2.1 para fazer o círculo como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 113-120. </li><li> Obter a diferença de valor entre os dois cálculos convolução de 4.1.2.1 e 4.1.2.2. </li><li> Repita os procedimentos acima de R S R = D / 2 a R S = 2R D, aumentando ambos os R e R S L com um nível de pixel. Faça uma iteração que contém códigos de origem de todo procedimento 4.1.2.1 a 4.1.2.3 para repetir. </li><li> Encontre o raio de R S que indica a máxima diferença de valor entre os dois cálculos convolução. Use função incorporada denominada &#39;max&#39; para encontrar o raio indica a máxima diferença de valor, como mostrado no código-fonte da linha de programa personalizado 148 a 149. Isso R S indica, assim, o raio da área escura na imagem de referência. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Cálculo de uma intensidade fraccionada <ol><li> Definir um círculo que contém uma posição central e um raio, determinado pelo procedimento 4.1 como uma região de interesse. </li><li> Calcular as intensidades médias da região de interesse em uma série de imagens de fluorescência em função do tempo. Convolute cada quadro com a região de interesse e dividi-lo pela área da região de interesse para calcular a intensidade média. Os detalhes estão disponíveis no código-fonte do programa personalizado que está disponível no site Jove. </li><li> Calcular uma intensidade fraccionada, definida como a equação abaixo, em que F (t) é a intensidade média do círculo que é uma região de interesse de acordo com o tempo, F I é a intensidade inicial no círculo, e Fo é a intensidade de um fundo branco. F (t) = (F (t) - M I) / (F O - F i) (Equação 1). </li></ol></li><li> Montagem da fintensidade ractional a teoria FRAP <ol><li> Montar a intensidade fracionária com a equação abaixo, onde τ é um tempo de difusão característica e eu 0, I 1 são funções de Bessel modificadas, utilizando um programa de ajuste, e obter τ <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> (Equação 2). </li><li> Obter um coeficiente de difusão a partir da relação, um τ = 2/4 D, em que D é o coeficiente de difusão e a é o raio da área escura. Nota: Durante o processo de ajuste, é possível mudar o perfil de intensidade fraccionada ao longo de um eixo de tempo, quando o processo de recuperação já começou, antes de gravar as imagens. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no competing financial interest.

Fram partilha uma grande quantidade de princípios fundamentais com FRAP, especialmente para medir a recuperação de fluorescência após branqueamento de uma área específica, mas FRAM utiliza um processo de fusão de uma gota sobre a interface plana para formar uma área branqueados, em vez de aplicar uma luz intensa. O processo de fusão é, portanto, passo mais importante no FRAM e, especialmente, a forma da mancha escura na monocamada plana após a fusão uma gota determina a precisão da medição diffusivity. Especificamente, com base num método de corrente, só definir o círculo com um raio R tal como uma região de interesse para calcular a intensidade média da mancha escura, mostrado no Procedimento 4, e se houver um excesso desvio da forma circular, esta iria perturbar a medição precisa de um coeficiente de difusão. Portanto, é necessário para obter uma forma circular região escura, mas, formatos não circulares são formados por vezes, devido a várias razões. Em primeiro lugar, se existe um fluxo convectivo na Petprato RI, a forma da área escura se torna alongada ao longo da direcção do fluxo. Como mencionado no procedimento 1.3, um aparelho de cone em forma de ajuda a suprimir o fluxo convectivo, e este alongamento seria minimizado. Em segundo lugar, se a extremidade da ponta do capilar toca a interface plana durante um processo de fusão, a área escura é formado com uma variedade de formas, desde o final capilar interrompe o processo de fusão. Através da obtenção de uma gota que só é pendurado a partir do fim do capilar, esta interrupção pode ser evitada. Em particular, um tratamento hidrofóbico do capilar ajuda a gota a sentar-se no final do capilar. Portanto, tiroteios problemas acima e modificações nos permitirá medir propriedades de difusão mais precisamente. Este processo também permite que solucionou assim FRAM ter várias vantagens significativas sobre FRAP. Em primeiro lugar, FRAM requer equipamento mais simples em comparação com FRAP. Para FRAM, é suficiente utilizar um simples micros fluorescênciaface, em vez de um microscópio confocal de laser caro, com um elevado poder de cujo comprimento de onda deve coincidir com o espectro de absorção do corante. Além disso, é necessária a utilização de material adicional para ajustar o tamanho da área branqueada na FRAP, enquanto o FRAM controla o tamanho da área facilmente ajustando o tamanho da gotícula, ou a pressão superficial na superfície da gotícula. Em segundo lugar, é possível utilizar espécies diferentes de corantes em FRAM. FRAP utiliza apenas moléculas de corante cujo processo de branqueamento é muito mais rápido do que o processo de difusão. Se a difusão dos corantes ocorre durante o processo de branqueamento, é difícil estimar com precisão a propriedade de difusão. Fram, no entanto, não necessita de um processo para o branqueamento de corantes e isto permite assim a utilização de vários tipos de tintas na imagem de fluorescência. Além disso, o FRAP requer lasers de alta potência e conjuntos de filtros adicionais para alterar as espécies de corante, embora seja apenas necessária para substituir os conjuntos de filtros no fram. Finalmente, Uma vez que as monocamadas na superfície das gotículas e a interface plana pode ser formada de forma independente, permitindo assim o estudo das diferenças inter-difusão ou de mistura entre duas monocamadas de lípidos diferentes por fusão de tipo A monocamada de tipo B em monocamada, enquanto o FRAP mede apenas o autodifusão de uma monocamada. Apesar dessas vantagens, o processo de fusão uma gota em uma interface ar-água plano pode potencialmente limitar esta técnica devido a vários problemas que podem ser motivo de preocupação, como uma incompatibilidade de pressão à superfície entre as duas monocamadas, a escala de tempo do processo de fusão , e um aumento da pressão superficial da monocamada de gotículas plana após a fusão. Estes problemas, no entanto, não afectam de forma significativa a medição de difusão pelas seguintes razões. Primeiro, embora as pressões de superfície nas duas monocamadas diferentes são bastante diferentes, um processo de equilíbrio é completada numa fase muito cedo durante o processo de recuperação. Por exemplo, se Tque a superfície de pressão da monocamada na superfície da gota que é superior ao da monocamada na interface ar-água plana, a área escura expande até que a pressão se equilibra superfície. Uma vez que este processo é completado dentro de 10 ms, a pressão de superfície irá ser equilibrada antes que afecta significativamente o processo de difusão. Em segundo lugar, se o intervalo de tempo do processo de fusão é suficientemente rápido, que não limita a difusão de medição em tudo. Felizmente, um processo de fusão típica também está concluída dentro de 10 ms. Finalmente, mesmo fusão de várias das gotículas para a interface plana não aumentar a pressão à superfície uma vez que a área da superfície da calha é muito maior do que a área de superfície da gotícula. De acordo com os tamanhos de cocho e as gotículas, descrito no protocolo, a área por molécula aumenta menos do que 0,015%, mesclando uma gota. Por conseguinte, o aumento da pressão superficial, devido à alteração da área por molécula é inferior a 0,1%, que é negligible porque é muito menor do que o erro típica na pressão de superfície, tal como medido pela placa de Wilhelmy tensiómetro. Em resumo, nós introduzimos um novo método para medir a propriedade difusão lateral de uma monocamada de fosfolípido, mesclando uma monocamada gota para a interface plana. Esta técnica exige um equipamento relativamente simples e também permite o uso de vários tipos de espécies de corante. Fram é, portanto, potencialmente aplicáveis ​​para a medição da difusão de quaisquer agentes tensio-activos, incluindo os fosfolípidos, copolímeros de bloco, proteínas e até nanopartículas numa interface fluido-fluido. Além disso, espera-se que o FRAM fornece um novo modo para estudar a inter-difusão ou de mistura entre dois agentes tensio-activos diferentes.

<html> Os fosfolípidos são os principais componentes das membranas celulares e as membranas de organelos, e a fluidez destas camadas de membrana frequentemente afecta as funções celulares através da alteração da actividade de proteínas de membrana 1 - 3. Por exemplo, a membrana &#160; homeostase de lípidos é conseguido através do controlo da fluidez da membrana, que é detectada por proteínas de membrana, e um nível anormal de fluidez provoca doenças graves, tais como colestase e esteatose hepática 4. Além disso, a fluidez de uma monocamada de fosfolípidos na interface fluido-ar alvéolos tem implicações importantes em suas funções. Alta fluidez da monocamada de surfactante pulmonar phospholipid facilita a propagação da camada durante a inalação, ao passo que uma fluidez baixo permite que a camada para permanecer dentro dos alvéolos durante a expiração 5,6. Assim, é importante para estimar a fluidez das camadas de fosfolipídios para entender seus papéis. _content &quot;&gt; uma medida directa da fluidez é a viscosidade, e a viscosidade das camadas de fosfolípidos foi medido por meio de colóides de tamanho micron-7, 8,9, magnéticos agulhas e micro-6,10,11 botões magnéticos. No entanto, estas técnicas estão limitados a películas relativamente rígidos, e não se pode medir filmes menos viscosos. Para tais casos, difusividade seria uma alternativa para quantificar a fluidez das camadas de fosfolípidos. Durante várias décadas, uma variedade de técnicas para medir as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos têm sido desenvolvidos, tais como fluorescência método de têmpera 12, gradiente de campo pulsado 13 RMN e espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) Um dos métodos mais representativas 14. é a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) 15,16. Devido à simplicidade do processo de medição e relacionada teorias, vários estudos sobre as propriedades de difusão de camadas de fosfolípidos foram realizadas utilizando FRAP <sup&gt; 17 - 19. No entanto, FRAP geralmente requer uma configuração de microscópio confocal caro, com um laser de alta potência. Aqui, nós apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de monocamadas de fosfolipídios, denominado como recuperação de fluorescência após a fusão (FRAM). A principal diferença entre FRAP e FRAM é que o passo fotodegradação passa a ter a coalescência gota. Juntar uma gota coberto por não-fluorescência monocamada numa monocamada plano marcado por fluorescência deixa uma mancha escura circular em uma monocamada plano brilhante, estabelecendo assim o mesmo estado inicial com o passo fotodegradação. Nós, então, observar a recuperação de fluorescência na mancha escura com o tempo para medir a difusividade lateral. Este novo &quot;branqueamento&quot; passo a coalescência gota fornece vantagens significativas em relação FRAP: Fram requer apenas um microscópio de fluorescência, em vez de um microscópio confocal caros com um laser de alta potência, que é necessário para FRAP. Eun disso, FRAM tem uma vasta selecção de corantes fluorescentes, uma vez que não envolve o processo de fotodegradação. Finalmente, as duas monocamadas diferentes, uma monocamada de gotículas e uma monocamada plana, pode ser preparado de forma independente, permitindo assim que a interdifusão a ser medido, enquanto FRAP só mede a autodifusão de monocamadas. FRAM fornece uma ampla gama de medidas de difusão de materiais de elevada viscosidade para materiais quase invíscidos. Em princípio, FRAM pode medir a difusividade máximo de 10 6 uM 2 / seg, que é comparável com as técnicas existentes, quando a difusão ocorre através da área de 100 um até 100 um, durante o tempo para o processo de coalescência gota (~ 10 ms). Além disso, o processo de difusão lenta pode ser facilmente medido a menos monocamadas são sólidos. Fram pode ser usado para quaisquer tipos de materiais tensio-activos, desde que as moléculas marcadas por fluorescência adequados estão disponíveis.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

Uma série de imagens de fluorescência foram obtidas com o tempo durante o processo de recuperação após a fusão de uma gotícula revestida com uma monocamada de DOPC sobre uma monocamada de DOPC plana, conforme indicado na Figura 1. A monocamada DOPC na interface ar-água plana foi dopado com pequenas quantidades de Rodamina-DPPE, e, assim, este tornou possível a visualização de um fundo com uma cor brilhante e uma região escura recentemente adicionado à interface plana. Há, um processo de recuperação foi observada a 23 mN / m de superfície de pressão fixa. Um ajuste da equação 1 para a mudança de intensidade fraccionada de acordo com o tempo é mostrada na Figura 2. O valor de R2 de este ajuste é 0.999, e este ajuste ainda funciona bem, mesmo a pressões de superfície elevadas ou mais baixas. O coeficiente de difusão da monocamada DOPC obtido a partir deste ajuste foi 27,54? M 2 / s a 23 mN / m de superfície de pressão. Para mais validação da FRAM, coeficientes de difusão da DOPC e dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) as monocamadas foram medidos de acordo com a pressão de superfície. Como mostrado na Figura 3, FRAM capta a rápida diminuição do coeficiente de difusão da monocamada de DPPC em ~ 9 mN / m de pressão de superfície, onde LC (líquido condensado) - LE (líquido expandido) de transição de fase ocorre 10, e os valores de coeficientes de difusão são também concordaram bem com as medidas anteriormente por Peters et al. 19. Além disso, um decaimento exponencial do coeficiente de difusão com a pressão de superfície foi observada em monocamada DOPC, e esta tendência é quase idêntico àquele medido por Caruso et al. 12. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> Figura 1. (A) Ilustração esquemática da FRAM (recuperação de fluorescência após a fusão) técnica. Como o lábioID de monocamada gota revestida é mesclado a interface ar-água plana, a monocamada lipídica sem fluorescência marcado lipídica é inserido no plano monocamada lipídica fluorescente. (Imagens B) microscópio de fluorescência com o tempo durante o processo de recuperação de uma monocamada de DOPC a 23 mN / m de superfície de pressão (escala bar = 100 pm). A região escura da monocamada DOPC está totalmente recuperado pelo processo de difusão dentro de alguns minutos. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> Figura 2. Fracção de intensidade versus tempo. Círculos pretos e a linha pontilhada cinza indicam os valores das intensidades fracionários obtidos a partir de análise de imagem (procedimentos 4.1 e 4.2) e o ajuste da equação 1 para as intensidades fracionários com o tempo,mostrado no procedimento 4.3, respectivamente. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> Figura 3. Os coeficientes de difusão de DOPC (triângulo) e DPPC (quadrado vazio) monocamadas em função da pressão à superfície. As linhas com a cor cinzento claro e com a cor cinzento escuro indicam os valores do coeficiente de difusão anteriormente relatado por Peters et ai. e Caruso et al., respectivamente. Este valor foi modificado a partir Jeong et al. 23. Reproduzido com permissão de Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Direitos de autor 2014 American Chemical Society. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique dela</a>e para ver uma versão maior desta figura.

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K visualizações.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioengenharia

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bioquímica

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biologia

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Imunologia e Infecção

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...