Name: Vídeo: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 11.8K visualizações. Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Agradecemos Sarissa Biomedical por seu trabalho no desenvolvimento dos sensores usados ​​no presente manuscrito. Esta pesquisa foi suportada pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122662 (A. Staruschenko e A. Cowley), um projeto financiado pelo Medical College of Comitê de Assuntos de Pesquisa Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e Avançando um Programa de Pesquisa e Educação saudável Wisconsin # 9520217, eo Young Investigator Grant do National Kidney Foundation (O. Palygin).

Os seguintes procedimentos com animais aderiram ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação prévia foi obtida de Cuidado e Uso Comitê Institucional Animal (IACUC). NOTA: Revisão das instruções do fabricante do sensor deve ser feito durante o delineamento experimental e antes da sua utilização. Seguindo estas instruções irá produzir os melhores resultados ao usar os sensores. Calibração do Sensor 1. <ol><li> Preparar soluções de fresco, antes do início da experiência. </li><li> Criar Tampão A contendo tampão NaPi 10 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, e 2 mM de glicerol. Ajustar o pH a 7,4 usando NaOH. Armazenar a 2-8 ° C. </li><li> Utilizando uma concentração de estoque de ATP (100 mM) armazenado a -20 ° C, criar uma nova solução de calibração 10 mM de ATP pela adição de 10 ul de estoque de 90 ul de tampão A. </li><li> Re-hidratar o sensor de ATP, colocando a sua ponta (Figura 2) em tele câmara de reidratação contendo Tampão A durante pelo menos 10 min a 2-8 ° C. NOTA: Após reidratação, os sensores não devem ser expostos ao ar durante mais de 20 segundos ou a sensibilidade do sensor pode ser reduzida. Se longas exposições ao ar estão previstos, mergulhe o sensor brevemente em uma solução de glicerol. Os sensores podem ser usados ​​para várias experiências, mas estas devem ocorrer no mesmo dia como sensor de re-hidratação. Os sensores podem ser armazenados na câmara de hidratação com tampão A para até 24 horas. </li><li> Ligue o potenciostato canal duplo (Figura 3) e iniciar o software do sistema de gravação. </li><li> Prepara-se uma câmara de calibração com 3 ml de tampão A. Coloque o eléctrodo de referência dentro da câmara de calibração. Tome cada sensor da câmara de reidratação, em seguida, anexá-lo ao manipulador e inseri-lo na solução de câmara de calibração. NOTA: Use um silicone revestido placa de petri padrão como uma câmara de calibração. Realizar todas as calibrações e studies em uma gaiola de Faraday em uma mesa de ar do laboratório de alta performance para reduzir o ruído do sinal durante as gravações amperometria (Figura 4). Calibrações são o melhor feito tão perto do início da coleta de dados possível. Para aplicações in vivo, o tempo óptimo para a calibração é animais durante o período de recuperação pós-cirurgia. </li><li> Ex vivo calibração <ol><li> Realizar voltametria cíclica na câmara de calibração e ligando os sensores de -500 mV a +500 mV a uma velocidade de 100 mV / seg durante 10 ciclos. Isto melhora grandemente a sensibilidade dos sensores. Veja a Figura 5 para os traços observados a partir dos 10 ciclos. </li><li> Polarizar os sensores a +600 mV após o último ciclo. O sensor de corrente irá decair para uma assíntota. Uma leitura de equilíbrio é atingido após um mínimo de 5 minutos. Registre a leitura do zero. </li></ol></li><li> In vivo calibração do sensor <ol><li> Não execute a voltametria cíclica na in vivo sensors. Em vez disso, polarizar o sensor na câmara de calibração durante 30 seg a 500 mV. Em seguida, defina o potenciostato a 0 mV e permitir que a corrente do sensor de subir para uma assíntota. A corrente do sensor vai demorar pelo menos 2 min a assíntota. Registre a leitura do zero. </li></ol></li><li> Consecutivamente adicionar conjunto quantidades de solução de ATP para dentro da câmara para produzir uma linha de calibração que abrange uma gama de detecção desejado. A solução ATP produz um pico acentuado no sinal do sensor inicialmente, seguido por um decaimento como o ATP difunde-se uniformemente ao longo da câmara. Valores de sinal de gravação uma vez que o nível do sinal se estabilizou após cada adição de ATP. As Figuras 6A e 7 mostram traços e sugere concentrações de ATP para tanto ex vivo e estudos in vivo, respectivamente. NOTA: É importante confirmar a selectividade dos eléctrodos usando sequestrantes dos analitos. O presente protocolo utilizado apirase para testar a especificidade do sensor de ATP e catalase para o H &lt;sub&gt; 2 sinal de O 2 (Figuras 6B). Se os medicamentos são para ser administrado, as medições da sua reactividade com os sensores deve ser determinada antes do estudo. </li><li> Adicionar 3 mL de apirase a partir de um stock de 2 mg / ml (89 NU / mg) para testar a especificidade do sensor de ATP (a corrente produzida por aplicação de ATP deveria reduzir ao nível zero (Figura 7). </li><li> Adicionar 3 mL de catalase a partir de um stock de 2 mg / ml (100 ONU / mg) para testar a especificidade do sensor nulo (a corrente produzida por aplicação de H 2 O 2 deve reduzir a leitura de zero). </li></ol> 2. Cirurgia animal para estudos de Sensores <ol><li> Cirurgia para ex vivo <ol><li> Anestesiar o animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. 15 &#39;12 animais devem ser monitorados continuamente para assegurar um nível adequado de anestesia. Streação taxa e toe pitada respiratório capaz são usados ​​para confirmar a anestesia adequada. Nota: eutanásia do animal de acordo com os protocolos aprovados IACUC. Após a conclusão de todos os procedimentos não-sobrevivência sacrificar animais profundamente anestesiados por toracotomia induzir pneumotórax para assegurar o desaparecimento humano do animal 12. </li><li> Colocar o rato sobre uma mesa cirúrgica de temperatura controlada em posição supina. Enquanto se mantinha uma profundidade anestésico adequado, fazer uma incisão na linha média de cerca de 5 cm em linha com o rim esquerdo e expor a aorta abdominal distai. </li><li> Enrole uma ligadura ao redor do artérias celíaca e mesentérica superior ea aorta abdominal acima dessas artérias, mas não ligar. Enrole duas ligaduras em torno da aorta abdominal abaixo das artérias renais. </li><li> Prenda o aorta abdominal acima das ligaduras. Amarre a ligadura inferior. Cateterize da aorta abdominal com tubo de polietileno (PE50). Fixe o cateter com a segunda ligadura aorta. </li><li> Retire o grampo e ligar os mesentéricos e celíacos artérias. Perfundir rim de 6 ml / min com Solução Salina Equilibrada de Hanks à TA, durante 2-3 min, até que o rim é completamente branqueados. </li><li> Excisar o rim e o cateter, ligado porção da aorta. Colocar o rim para um prato de Petri de 3 ml cheio com solução de banho. Nota: protocolo de experiência pode ser realizada à temperatura ambiente. A solução do banho contém em mM: 145 de NaCl, 4,5 de KCl, 2 de MgCl2, 1 de CaCl2, 10 de HEPES, pH 7,35 ajustado com NaOH. </li></ol></li><li> Cirurgia para in vivo <ol><li> Anestesiar ratos utilizando protocolos aprovados IACUC. Para a análise in vivo anestesiar os ratos com cetamina (20 mg / kg IM) e inactina (50 mg / kg ip). Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir um nível adequado de anestesia. Uma reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada. </li><li> Depois de profundidade anestesia adequada é obterEd, colocar o rato na posição supina sobre uma superfície ligada à terra, com temperatura controlada localizado sobre a mesa de ar. A superfície deve ser pré-aquecido e mantido a 36 ° C. </li><li> Enquanto se mantinha a profundidade da anestesia adequada, fazer uma incisão na linha média cerca de 5 cm em linha com o rim. </li><li> Usar um sutura para desviar e ancorar no tecido cutâneo e subcutâneo para que todo o rim é visível. Coloque o rim em um copo rim para minimizar os artefatos de movimento. </li><li> Utilize uma infusão IV de 2% de BSA: 0,9% de NaCl a 1 ml / 100 g / hr através da veia jugular para manter o volume de sangue. Canular ambos os ureteres para a coleta de urina. Coloque os laços em torno das artérias mesentéricas e celíacas superior ea aorta distal para a manipulação de pressão de perfusão renal (Figuras 10A). </li><li> Se a aplicação de agentes farmacológicos é necessário durante os experimentos in vivo, a inserção de um cateter intersticial é recomendada (Figuras 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Setup 3. Aquisição de Dados <ol><li> Abra o programa de aquisição de dados e definir a sua polaridade para ambos ex vivo e in vivo para Anodic positiva. Configure o programa para salvar dados como código ASCII. </li><li> Posicione os micromanipuladores para inserção rápida dos sensores para os rins. NOTA: Como alternativa, utilizar uma sonda ligada ao manequim micromanipulador para ajudar a conseguir o posicionamento desejado de sensores. </li><li> Ex vivo de aquisição de dados <ol><li> Perfundir o rim com uma solução de banho (a partir de 2.1.6) através da aorta foi canulada com uma taxa constante de 650 ul / min. Utilizando uma tesoura cirúrgica, cuidadosamente remover a cápsula do rim, o que é necessário para a inserção do sensor. </li><li> Fixar o rim com bandas de borracha sobre o rim amarrados e ligados ao prato revestido de silicone com pinos. </li><li> Colocar o eléctrodo de referência próximo do rim na placa de Petri com a sua ponta submersa ema solução tampão. </li></ol></li><li> Na aquisição de dados vivo <ol><li> Coloque o rim em um copo de rim. Dependendo da estirpe e idade do animal usar um tamanho de copo que contém o rim frouxamente. A Figura 8 mostra dois tamanhos de copos nos rins. Copos semelhantes são usadas para diferentes abordagens fisiológicas voltadas para a análise da função renal, tais como micropunção etc 16. Nota: A posição da taça do rim é crítica para remover o ruído mecânico produzido pela respiração animal, mas não deve interferir com a perfusão do rim ou bloquear o fluxo ou urina. </li><li> Permitir que 45 min de tempo de recuperação antes de realizar a coleta de dados. </li><li> Usando uma agulha 26-30G, fazer um buraco punção no local desejado e a profundidade do sensor no rim. Blot o buraco superfície para remover o sangue emanava. Adicionar solução de glicerol na superfície do rim. Isto irá evitar que a superfície do rim de secar durante a experiência. </li&gt; <li> Retire o primeiro sensor da câmara de reidratação e anexá-lo ao micromanipulador. Rapidamente, dentro de 20 segundos, inserir o eléctrodo dentro do buraco criado recentemente no rim. Repita os passos de 3,5-3,9 para o sensor nula. </li><li> Insira o eletrodo de referência para o rim, aproximadamente 1 cm a partir dos sensores. </li></ol></li><li> Ligue o potenciostato e activar o programa de gravação no computador. A Figura 9 mostra a configuração final do ex vivo de aquisição de dados do rim. A Figura 10 mostra a configuração final do rim de aquisição de dados in vivo com um cateter inserido. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Importar o arquivo de dados ASCII em origem ou qualquer outro software semelhante. </li><li> Relação atual concentração <ol><li> Use a função de ajuste / extrapolar linear para construir uma concentração linear (eixo x) para corrente (eixo y) relação para a ATP ou H 2 </sub&gt; O 2 pontos de calibração (Figuras 6 e 7). linear linha de ajuste: y = mx + b </li></ol></li><li> Equiparar a corrente a concentração </li><li> Subtrair os vestígios de medição do sensor nulo das do sensor de ATP para obter a corrente real produzida pelo ATP intracelular. </li><li> Converter os valores de ATP no PA obtidos por amperometria para nm, utilizando a equação de calibração detalhado em 4.2.1. Determinar a concentração do traço do sensor de ATP dados subtraídos importando cada corrente ajustada para o valor &quot;X&quot; e resolvendo para y (a concentração da substância a analisar). </li><li> Da mesma forma, calcular H 2 O 2 a partir da sua concentração equação de calibração, se necessário. </li></ol>

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Sensores para a gravação do vídeo deste manuscrito foram fornecidas pela Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Reino Unido).

Os actuais protocolos foram desenvolvidos para proporcionar maior resolução temporal e espacial da sinalização de ATP e H 2 O 2 para rins perfundido de sangue ex vivo isolados, perfundidos e in vivo. As diferenças entre os protocolos e os sensores usados ​​aqui fornecem aquisição de dados ideal tanto para agentes farmacológicos ou estudos fisiológicos. Os protocolos consistem de 1) a calibração do sensor, 2) procedimento cirúrgico, 3) de configuração de aquisição de dados...

Biossensores microeléctrodo enzimática (também referida como sensores no presente manuscrito) ter sido uma ferramenta valiosa para estudar processos dinâmicos de sinalização em células e tecidos vivos. Os sensores proporcionam uma maior resolução temporal e espacial das moléculas de sinalização celular nas concentrações biologicamente relevantes. Em vez de amostragem e análise de fluidos extracelulares tomadas em intervalos durante longos períodos de tempo, estes sensores responder tão rápido quanto suas enzimas reagem com o analito, produzindo, assim, as medições em tempo real de 1,2. Detecção rápida de concentrações intersticiais de factores autócrinos e parácrinos, como purinas ou peróxido de hidrogénio, e a dinâmica da sua libertação pode ser utilizada para estabelecer um perfil para os efeitos da droga em condições normais e patológicas 3. Actualmente, a maioria das aplicações que usam sensores têm sido cérebro em lâminas de tecido e culturas de células 4-10. Os protocolos detalhados nesta objetivo manuscrito paraestabelecer os meios para medir com precisão concentrações em tempo real dos analitos em rins inteiros. Os seguintes protocolos foram desenvolvidos para estudar ATP intersticial e H 2 O 2 a sinalização em rins. No ambiente nativo do rim, ATP extracelular é rapidamente catabolizado por ectonucleotidases endógenos em seus derivados (ADP, AMP e adenosina). Os sensores usados ​​aqui são altamente seletivas para ATP sobre outras purinas ou ATP produtos de degradação 11. Isto oferece uma grande vantagem, pois permite um acompanhamento preciso das concentrações constantes e dinâmicas de libertação de ATP e sua função de sinalização. Intersticial concentração de ATP é medida utilizando a combinação de dois micro-eléctrodos, um sensor de ATP e um sensor nulo. O sensor nulo em combinação com catalase aplicações é capaz de detectar intersticial H 2 O 2 a 12 concentrações. Os seguintes protocolos de usar dois modelos diferentes de sensoRS que possuem características ideais para tanto ex vivo ou em aplicações in vivo. Ambos os modelos são baseados na reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e oxidase de glicerol-3-fosfato contido em uma camada de sensor enzimática e é accionado pela presença de ATP. No conjunto de sensores utilizados nos estudos ex vivo, H 2 O 2, o produto final da reacção enzimática, é detectada por oxidação sobre um catalisador de platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Sensores para estudos in vivo em vez disso são baseados em H 2 O 2 a redução em um eletrodo de ouro mediador revestidos específicos para o tecido perfusão de sangue. Mostrado na Figura 1 é um esquema de ambos os protocolos descritos neste manuscrito. O sensor Null é idêntico ao seu sensor de ATP correspondente exceto ela não tem as enzimas ligadas. Portanto, para além da detecção de H 2 O 2 com a enzima de catalase, o sensor de MEA nuloSures interferências não específicas. Concentrações de ATP são calculados subtraindo o Null detectadas interferências não específicas e fundo H 2 O 2 a partir do sinal do sensor de ATP. Vários sensores também estão comercialmente disponíveis para a detecção de outros analitos, incluindo a adenosina, ionosine, hipoxantina, acetilcolina, colina, glutamato, glucose, lactato, d-serina por ex vivo aplicações ou adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo, quando emparelhado com o nulo corresponde sensor. A capacidade de o sensor detectar com precisão analitos depende da pré adequada e calibrações pós-13. Isto assegura que a análise representa o desvio na sensibilidade do sensor, que ocorre durante a utilização em tecidos biológicos. O sensor contém um depósito de glicerol que é utilizado como um reagente nas reacções enzimáticas do sensor. Se o sensor não é utilizado em soluções contendo glicerol de banho, que deve perder ao longo do tempo. Shorter recording vezes são, então, necessárias para minimizar a deriva do sensor. Além disso a incrustação do sensor por proteases endógenas e os fragmentos de proteínas podem diminuir significativamente a sensibilidade dos sensores 14. O presente manuscrito estabelece o uso de biossensores microeletrodos enzimáticas para a ex vivo e em preparações in vivo de rim. Em tempo real quantificação do analito fornece detalhes sem precedentes de sinalização celular que pode revelar novos insights sobre os mecanismos de doenças renais e agentes farmacológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Biossensores microeléctrodo enzimáticas têm sido amplamente utilizados para medir a sinalização extracelular em tempo real. A maioria da sua utilização tem sido limitada a fatias de cérebro e cultura de células neuronais. Recentemente, esta tecnologia tem sido aplicada aos órgãos inteiros. Avanços em design de sensor tornaram possível a medição de sinalização celular em em rins vivo perfusão de sangue. Listar os atuais protocolos os passos necessários para medir ATP e sinalização H 2 O 2 no interstício do rim do rato. Dois modelos de sensores separados são usados ​​para o ex vivo e in vivo protocolos. Ambos os tipos de sensores são revestidos com uma fina biolayer enzimática no topo de uma camada de permeabilidade selectiva para dar resposta rápida, biossensores sensíveis e selectivos. A camada de permeabilidade selectiva protege o sinal a partir dos interferentes no tecido biológico, e a camada enzimática utiliza a reacção catalítica sequencial de glicerol cinase e glicerol-3-fosphate-oxidase na presença de ATP para produzir H 2 O 2. O conjunto de sensores utilizados para os estudos ex vivo mais analito detectada por oxidação de H 2 O 2 em uma platina / irídio eléctrodo de fio (Pt-Ir). Os sensores para os estudos in vivo são, em vez baseado na redução de H 2 O 2 em um eléctrodo de ouro revestido mediador concebido para o tecido perfundido de sangue. Mudanças concentração final detectado por amperometria são em tempo real seguido de calibração de concentrações conhecidas de analito. Além disso, a especificidade do sinal amperométrico pode ser confirmada pela adição de enzimas como a catalase e apirase que quebram H 2 O 2 e ATP correspondentemente. Estes sensores também dependem fortemente de calibrações precisas antes e depois de cada experimento. Os dois protocolos seguintes estabelecer o estudo de detecção em tempo real de ATP e H 2O 2 em tecidos renais, e pode ser ainda modificado para prolongar o método descrito para o uso em outras preparações biológicas ou órgãos inteiros.

O design do biossensor microeléctrodo enzimático permite a detecção em tempo real dos analitos em rins inteiros. A concepção geral para qualquer experiência ex vivo ou estudos in vivo é ilustrado na figura 1 os sensores .Os utilizada e os procedimentos cirúrgicos diferentes, dependendo se o estudo é ex vivo ou in vivo. Para obter resultados reprodutíveis, pré precisas e calibrações pós são críticas. A figura 6A mostra</stro...

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; Ó<sub&gt; 2</sub&gt; No rim

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K visualizações.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

Vídeo: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biologia

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H

Resumo

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