The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. Avaliação GI 50 para o composto (s) de interesse <ol><li> Gerar curva (s) de crescimento de linhas celulares de interesse para avaliar a densidade de sementeira apropriada. Traçar O número de células em vários pontos de tempo após a sementeira (dias 2, 4, 6 e 8) em relação ao dia 0. Isto proporcionará uma taxa de crescimento relativo da linha de células de interesse e deve ser utilizado para avaliar a densidade de sementeira inicial de tal modo que confluência não é atingido em placas de 96 poços no prazo de 7 dias. </li><li> Uma vez que as curvas de crescimento foram determinadas, semente número adequado de células em não-transparente, claro fundo placas de 96 poços em 100 ul de meio de células para avaliar GI 50. Semente o número de células com base na linha celular utilizada e determinada em 1,1. Normalmente, sementes 3x10 3 células para linhas de células de crescimento rápido com um tempo de duplicação de ~ 24 horas, por exemplo., HCT116. <ol><li> Prepara-se uma placa de ensaio (dia-1). Para a placa de ensaio, as células semente com uma densidade desejada em 100 ul de meio de cultura In poços sombreados em azul (Figura 1). Wells em destaque na branco contêm apenas mídia. </li><li> Prepara-se uma placa de controlo (dia-1). Para a placa de controlo, semear a mesma densidade das células como no passo 1.2.1 em 100 ul de meio de cultura em separado uma placa de 96 poços. Este &quot;Dia 0&quot; leitura vai ajudar na interpretação da natureza citostático / citotóxica dos compostos que está sendo analisado (Figura 2). </li></ol></li><li> No dia seguinte (dia 0), ler a placa de controle. Equilibrar reagente de viabilidade celular luminescente (substrato CellTiter-Glo misturado com tampão de acordo com as instruções do fabricante) para a TA e agitar suavemente o conteúdo por inversão para se obter uma solução homogénea. Adicionar 80 ul de reagente a 100 ul de células / mistura meios e agitar o conteúdo durante 30 min para induzir a lise celular. <ol><li> Grave luminescência com um luminómetro definida para uma exposição de 0,1-1,0 segundos e detecção de comprimento de onda de 560 nm. </li></ol></li><li> Adicionar os compostos de teste (compostosde interesse) para testar as placas (dia 0). Fazer uma diluição 1: 4 em série dos compostos em DMSO, a concentração final de 200x, para um total de 10 concentrações (diluições contendo o composto 9 e apenas um de DMSO, a placa de composto). Como um ponto de partida inicial, o objectivo para uma dose 200x menor de 0,03 mM e uma dose superior de 2.000 mM (volume final de 200 ul). </li><li> Adicionar compostos serialmente diluídos para meio para fazer uma mistura composto-forma numa concentração final 10X (volume final de 100 ul, a placa intermediária). Armazenar a placa de composto a -20 ° C para utilização no dia 3 do ensaio. Adicionar 10 uL de mistura de composto de médio a células em triplicado de modo a que a dose mais elevada é 10 uM (por ex., As linhas B, C e D, dia 0) (Figura 1). Incubar as placas de ensaio durante 3 dias a 37 ° C. Descartar placa intermédia (s) após o uso. </li><li> No dia 3, preparar uma mistura de composto 400 ul de meio 1x utilizando as placas de composto preparado no passo 1.4. Inverta placas de ensaio para remover mídia e seque em autotoalhas de papel claved 2-3x para remover mídia residual. Adicionar composto / meios (100 ul / poço) para poços sombreadas em azul e adicionar 100 ul de meios de perímetro poços para evitar a evaporação (Figura 1). Re-incubar as placas de ensaio a 37 ° C durante um período adicional de 3 dias. </li><li> No dia 6, avaliar o número relativo de células viáveis ​​através da realização de uma leitura de luminescência, tal como descrito na etapa 1.3. </li><li> Use a leitura dia 0 para avaliar a natureza estática / tóxico de compostos. Agentes tóxicos induzir a apoptose enquanto os agentes citostáticos induzir parada do ciclo celular. Se o composto é tóxico (dia 6 leitura está abaixo de dia 0 leitura), considere a escolha de GI 50, e GI 50 x 5 concentrações para os testes de resistência. No entanto, se o composto induz a estase (igual a ou maior do que a leitura D0), considere GI 100 e 100 GI X5 para os ensaios de resistência (Figura 2). </li></ol> 2. Criação de drogas Resistência Assays <ol><li> Se a sagacidade de trabalhoha agente citostático, as células semente em uma confluência de 30-40% em 150 mm 2 pratos de cultura de tecidos (volume = 30 ml) para o ensaio de resistência. Se trabalhar com um agente tóxico, semear a uma confluência de 70-80%. </li><li> Para linhas de células que abrigam um mecanismo de reparação de emparelhamentos incorrectos intacta (MMR), incubar as células do passo 2.1 O / N a 37 ° C com o agente cancerígeno de N-etil-N-nitrosoureia (ENU). Tratar as células com 30 ul de uma solução de estoque de 50 mg / ml ENU (concentração final 50 ug / ml) para aumentar a instabilidade do genoma. Para linhas de células que possuem um defeito MMR (Tabelas 2 e 3), o tratamento com ENU ou outras substâncias cancerígenas pode não ser necessário. <ol><li> Para outras linhas celulares, determinar MMR-deficiência por critérios NCI usando microsatélites instabilidade 12, ou com base na caracterização publicada utilizando ensaios de instabilidade de microssatélites ou perfil genômico / epigenômico de genes MMR 13-15. </li></ol></li><li> Células trata-se com o composto de teste (s) deinteresse na concentração determinada no passo 1.8. Para os compostos altamente tóxicos que causam a morte celular num ensaio de viabilidade de três dias típico 10, começar com um tratamento de dose baixa (ou seja, GI 50) e progressivamente aumentar a concentração (múltiplos de GI 50) de composto até cada 2-3 semanas robusta resistência é observada. Reabastecer de mídia e agravar a cada 3 d. </li><li> Uma vez que a selecção foi iniciada, mudança media / composto misturar a cada 3-4 dias até clones resistentes emergem. Resistência, por definição, surge quando as células tratadas mostram um maior crescimento / viabilidade durante o tratamento da droga em relação ao tratamento agudo de células de controlo tratadas com DMSO. </li></ol> 3. isolamento de clones de uma única célula <ol><li> Examine cultura prato usando microscopia de contraste de fase (ampliação de 40x) para clusters de células viáveis. </li><li> Clones satisfatórios de interrogação no fundo do prato com uma caneta de marcação. Escolha clones que são de tamanho médio (colônias maiores podemoriginários de várias células) e bem isolado a partir de outras colónias. Escolha clones usando uma das duas abordagens descritas no passo 3.3. </li><li> Método 1: Utilizando um pipetador (Figura 3) <ol><li> Remova a mídia de crescimento e enxágüe com 1x PBS para remover quaisquer células flutuantes. </li><li> Use marcas pretas como guia para &#39;colheita&#39; clones com ponta de pipeta (anexado a pipeta, p200 de preferência). </li><li> Clones de transferência para placas de 48 poços com 200 ul de meio fresco (com uma concentração metade composto para permitir a recuperação óptima de células). </li><li> Permitir que as células recuperar durante 2-3 dias antes de adicionar 200 mL de mídia fresco / concentração composto ideal. </li><li> Continuar a mudar media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li><li> Abordagem 2: Usando clonagem de discos (Figura 3) <ol><li> Marque clones como descrito no passo 3.2. </li><li> Colocar 3 milímetros discos de clonagem em uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 5 ml de 0,25% trypsin-EDTA durante 2 min. </li><li> Aspirar media de prato contendo clones resistentes e sobrepor clones com tripsina embebido discos de clonagem utilizando fórceps estéreis descartáveis. </li><li> Deixar durante 1-2 min, dependendo da facilidade com que os clones levantar as placas, num banho a 37 ° C incubadora. </li><li> Pegue clonagem discos usando uma pinça estéril e transferir para placas de 48 poços com 200 ul media frescos e metade concentração do composto. </li><li> Pipeta-se para baixo e ligeiramente para desalojar as células a partir de discos de clonagem e incubar O / N a 37 ° C (deixar em discos de clonagem de poços). </li><li> Na manhã seguinte, remova os discos de clonagem a partir de placas de 48 poços e encher os poços com 200 ul fresco media / composto (concentração do composto de metade ideal). </li><li> Três dias mais tarde, reabastecer de mídia com a concentração ideal do composto. </li><li> Continuar a mudar o media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li></ol> 4. Avaliação Grau de Resistance de Isolado Clones <ol><li> Uma vez que 10-20 colónias são expandidos, geram IG 50 curvas, tal como descrito no passo 1 para avaliar o grau de resistência. </li><li> Sempre incluir populações de controlo tratados com DMSO durante o processo de seleção. É muito provável que o espectro de resistência vai ser grande (alguns mostrando parcial enquanto outros mostrando resistência completa). Recolha algumas clones de cada uma destas classes como o mecanismo de resistência pode variar entre os dois grupos. </li></ol> Sequenciamento 5. Próxima geração <ol><li> Girar 2 milhões de células (controlo) e os clones resistentes (500 xg durante 5 min) em 15 ml de frascos cónicos para ambos ADNg e recolha de RNA (por conseguinte, 2 x 2 milhões). </li><li> Lavar duas vezes com PBS 1x e congelar em aglomerados -80 ° C até estar pronto para o isolamento. </li><li> Use um kit de extração comercial para isolar RNA ou gDNA de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Enviar amostras para sequenciamento de última geraçãousando o protocolo do fornecedor 10. </li></ol> 6. Bioinformática análise de amostras (whole-exome sequenciação) <ol><li> Preprocess sequência de dados de acordo com a melhor prática DNA-seq gasoduto 16. <ol><li> Mapear todas as leituras para fazer referência GRCh37 genoma humano utilizando BWA 17. Converter descompactados alinhamentos SAM formatadas para o formato BAM comprimido com Samtools 18. Classificar alinhamentos por coordenar com Samtools. Adicionar grupos de leitura usando Picard. (Para BWA específico, Samtools e Picard comanda, consulte Suplementar Text 1, linhas 1-4) </li><li> Mark todas as duplicatas lê usando os MarkDuplicates comando da ferramenta Picard definido 19. Índice este arquivo com Samtools. (Texto Suplementar 1, linhas 5-6) </li><li> Para minimizar bases não correspondentes em todos os lê, lê realinhar localmente em regiões que abrigam pequenas inserções ou exclusões usando uma realigner indel 20. (Texto Suplementar 1, linhas 7-8) </li><li> Para melhorar ainda mais o Accuracy da chamada variante, os escores de qualidade de base empírica recalibrar usando uma ferramenta de recalibração índice de qualidade base. A ferramenta de calibração da qualidade de base deve não só o índice de qualidade inicial correto, mas também ter em conta covariation de vários recursos, incluindo leitura de grupo, ciclo da máquina, posição de base, e contexto dinucleotide (bases atuais anteriores +). Gerar BAM recalibrado com PrintReads Picard. (Para comandos específicos para esta etapa, consulte Suplementar Text 1, linhas 9-10) </li><li> Repita os passos 6.1.1 através 6.1.4 (Texto Suplementar 1, linhas 1-10) para cada amostra sequenciada. </li></ol></li><li> Identificar a variação de nucleotídeo único (SNV) em cada clone usando uma variante emparelhado chamando tool19, 21-23. Para cada clone sequenciado, variante emparelhado executar chamando usando o clone parental como o combinado &quot;normal&quot;. (Recurso Text 1, linha 11) </li><li> Filtro recorrentes, variantes de alta qualidade e se preparar para anotação com uma ferramenta de anotação variante 24. Deprioritize variants não é comum a todos os clones resistentes. (Veja R roteiro em Suplementar Text 2) </li><li> Anotar variantes com uma ferramenta de anotação 25, 26. Muitas ferramentas de anotação variante tenho um aplicativo web que acompanha permitindo que os dados sejam enviados e processados ​​por um servidor remoto. </li><li> Use uma ferramenta de previsão do impacto funcional 27-29 de priorizar as variantes previstas de ter alto impacto funcional. Como anotação variante, várias ferramentas estão disponíveis para a previsão do impacto funcional através de uma interface web. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

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Seleção de linha (s) celular: Caracterização do estado genético e instabilidade genômica Sem dúvida, o factor mais importante na descoberta de mecanismos de resistência com sucesso clinicamente relevantes é a seleção inicial da linha celular. Dois factores devem ser considerados. Em primeiro lugar, o objectivo de seleccionar a linha de células (s) da mesma linhagem / subtipo abrigar os traços genéticos que definem a doença (por exemplo., BRAF V600E em melanoma). Interrogatório de dados transcriptomic e mutação publicamente disponíveis para ambas as linhas de células 30-32 e tumores primários / metástase para uma variedade de indicações 33,34 facilitará o processo de seleção. Embora a identificação de linhas celulares com alterações genéticas clinicamente relevantes é ideal, em alguns casos, isto pode não ser possível devido à falta de linhas celulares disponíveis ou viável devido a factores tais como a dificuldade e duração do processo de triagem. <p class="jove_content"&gt; Com relação ao ponto acima mencionado, um segundo fator a considerar, em seguida, durante a seleção de linha celular é a facilidade ou viabilidade de resistência rastreio utilizando a linha desejada. Por exemplo, factores tais como a proliferação e taxas de mutação intrínsecas podem ter grande impacto na velocidade de descoberta. Para esse efeito, as linhas celulares podem ser utilizadas com uma cinética de crescimento mais rápidas e deficiente em mecanismos de ADN MMR na esperança de que o surgimento de resistência espontânea pode ser acelerada 35. Com base no banco de dados cósmicos, várias linhas celulares candidatas existir com deficiência de um dos dois genes MMR frequentemente mutados MSH2, MLH1 ou (Tabelas 2 e 3). Alternativamente, se as linhas celulares de interesse, não existem defeitos de rolamento na MMR, o tratamento agudo com mutagénios químicos ou físicos ADN reactivo, tal como o agente de alquilação N-etil-N -nitrosourea (ENU) pode ser usado para aumentar a instabilidade do genoma. Apesar de ambas as abordagens podem significativamente de sHorten o tempo para atingir os clones resistentes e seguimento de sequenciação, ensaio funcional rigorosas deve ser realizada em genes candidatos como um maior número de não-funcional, mutações de passageiros é provável que surjam. SNVS pode ser posto ordenou para maximizar as chances de identificação de mutações funcionalmente relevantes. Em primeiro lugar, escolha dessas mutações que são recorrentes em clones independentes vai aumentar a probabilidade de estas mutações são drivers de resistência. No caso mutações recorrentes não são identificados, concentrando-se em SNVS que se encaixam no mecanismo de acção do fármaco (por exemplo, o alvo da droga ou um efector a jusante do conhecido fármaco alvo) pode ser significativa. Em última análise, o padrão-ouro é sempre a avaliação experimental da atividade de resistência concessão dos SNVS candidatos por expressão cDNA ectópica em células parentais sensíveis à droga. DNA vs RNA seqüenciamento Uma vez que os clones resistentes foram gerados, ADN e / ou ARNpode ser sequenciado de acordo com a necessidade. A sequenciação de ADN, quer exome ou todo o seqüenciamento do genoma, permitirá a identificação de germinativas e somáticas variantes, tais como SNPs, indels e número do exemplar variantes. Considerando que o mais exome seqüenciamento custo-friendly centra-se na geração lê a partir de regiões codificantes conhecidos, todo o seqüenciamento do genoma irá gerar dados de seqüenciamento de todo o genoma que possam facilitar a identificação de mutações em elementos não-codificantes, como potenciadores ou miRNAs 36. No entanto, uma vez que a expressão do gene de dados não é calibrada durante a sequenciação de ADN, é difícil prever qual a mutação (ões) é provável que seja um condutor funcional. A este respeito, a sequenciação de ARN, ainda mais dispendiosos, oferece esta vantagem. O facto de que a mutação de chamada é realizada apenas em espécies de ARN expressas aumenta a probabilidade de que a mutação de interesse pode ser um condutor funcional. Além de permitir uma pesquisa mais focada de mutações para testes funcionais de seguimento, RNA sequenciamento tambémoferece a vantagem adicional de ser capaz de identificar alterações no gene expressão, splicing alternativo e novas espécies de RNA quiméricos, incluindo fusões de genes que podem também servir como motoristas potentes de resistência. Pipeline de Bioinformática Comandos de exemplo são fornecidos para fins de ilustração, mas uma documentação mais detalhada e tutoriais estão disponíveis a partir do Broad Institute 16 e devem ser lidas cuidadosamente antes de começar a análise NGS. Os comandos a seguir são projetados para um ambiente UNIX shell em um sistema no qual todas as ferramentas e dados de referência ter sido pré-instalado. Estes comandos também assumir FASTQ arquivos contendo seqüência emparelhados-end lê a partir de duas amostras, com o nome &quot;parental&quot; e &quot;resistentes&quot;, foram recebidas do fornecedor e colocado no diretório &quot;data&quot;. Na maioria dos casos, esses comandos devem ser adaptadas ou optimizados para uma aplicação específica usando arg de linha de comando adicionaldo- (por exemplo, acrescentando &quot;-t 8&quot; para o comando BWA permite o funcionamento de vários segmentos por 8 núcleos de CPU). Grupos de leitura (que atribuem alinhamentos de amostras biológicas), muitas vezes deve ser adicionado a arquivos BAM, mesmo se houver apenas uma amostra por arquivo bam, a fim de cumprir com os requisitos de formato de arquivo para certas ferramentas. Leia parâmetros do grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB podem ser strings arbitrárias descrevendo o nome da amostra, plataforma de sequenciamento e estratégia biblioteca. In vitro vs ensaios in vivo Apesar de vários mecanismos de resistência identificados por seleção in vitro foram verificados para ser clinicamente relevante, existe uma possibilidade de que os mecanismos não podem servir como mecanismos relevantes ou predominantes de resistência clínica. Uma razão para isto pode incluir um papel essencial para o micro-ambiente na condução resistência à terapia, um componente que é desprovida no protocolo experimental / d configuraçãoiscussed até agora. De facto, vários estudos têm demonstrado que os agentes anti-cancro que são capazes de matar células tumorais são alteráveis ​​quando as células tumorais são cultivadas na presença de células estromais que implica mecanismos inatos de resistência conferida pelo estroma 37,38. Para identificar esses mecanismos de resistência adquirida induzida pelo estroma, pode-se considerar a realização in vitro de co-cultura ou em ensaios de resistência do tumor in vivo. Uma vez que o ensaio anterior é bastante complexo, muitos têm recorrido a geração de xenoenxertos de tumores resistentes aos medicamentos para tratar o papel potencial do estroma na resistência ao avanço. Tais estudos revelaram ambos os únicos 5 e 39 idênticas mecanismos de resistência relativa à selecção in vitro, o que implica que o estroma podem de facto, desempenhar um papel no último. No entanto, é preciso estar atento ao período de tempo que pode demorar para gerar tais tumores resistentes e da complexidade do acompanhamento genômica análise complexitie-s por causa da heterogeneidade molecular e celular intra-tumoral. A identificação do alvo Além de revelar os mecanismos de resistência a drogas, esta abordagem baseia-perfilamento genómico NGS também pode ser aplicado para identificar alvos celulares de sondas químicas. Historicamente, vários métodos imparciais têm sido usados ​​para identificar os mecanismos celulares de ação e metas de produtos químicos de baixo peso molecular com atividades biológicas, incluindo a purificação por afinidade, juntamente com a proteômica quantitativa, métodos genómicas de levedura, triagem RNAi, e inferência computacional abordagens 40. Como uma extensão para a elucidação dos mecanismos de resistência a drogas usando perfil genômico ou transcriptomic baseado em NGS de populações de células fenotipicamente resistentes, identificação de variações exclusivas recorrentes de nucleotídeo único (SNVS) ou alterações de expressão que permitem resistência pode oferecer insights sobre alvos celulares funcionais dos compostos. To baseia-se na ideia de que um subconjunto de mecanismos de resistência observado pode envolver mutações recorrentes em genes que codificam as proteínas alvos directos da molécula pequena. Recentemente, vários relatórios validou a utilidade da abordagem, particularmente através da combinação com outras abordagens, incluindo em grande escala de células de cancro A linha de perfil de sensibilidade, para revelar os alvos celulares de pequena molécula sonda 9,10.

Caracterização molecular detalhada de genomas de tumor por tecnologias de sequenciação e robustas ferramentas analíticas melhorada dados levou à descoberta de alterações genéticas importantes em tipos específicos de cancro 1,2. Desenvolvimento de terapias específicas destinadas a essas alterações genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, melhoraram significativamente a qualidade de vida dos pacientes 1,2. No entanto, apesar da especificidade desta abordagem, a resposta clínica para a maioria das terapias individuais tem sido sub-óptima em última análise, como a resistência emerge. Recentemente, progressos significativos foram feitos na compreensão das bases moleculares de resistência à terapêutica alvejados. Curiosamente, torna-se evidente que um mecanismo importante de resistência envolve a atividade de destino / caminho persistente. Como um caso em apreço, receptor de andrógeno (AR) -directed tratamento enzalutamida de câncer de próstata leva ao enriquecimento de mutações ativadoras em si AR, mantendo outp de sinalização ARut na presença de inibidor a 3-5. Este conhecimento tem conduzido a uma campanha agressiva para 1) desenvolver antagonistas da terceira geração que pode continuar a suprimir tanto a WT e função mutante-AR em enzalutamida resistente CaP 3 e 2) identificar potenciais gânglios a jusante de sinalização de AR que pode ser alvo de intervenção terapêutica . Da mesma forma, a resistência a outras classes de inibidores tais como aquelas voltadas para EGFR, BRAF e ABL muitas vezes levar a mutações que reativam a quinase via viciante original é 1. Com o conhecimento de que a resistência surge inevitavelmente na maioria dos pacientes, desenvolvendo abordagens para rapidamente trazer esses mecanismos à luz permitirá o desenvolvimento de terapias de acompanhamento eficazes. Uma abordagem que está sendo amplamente utilizado é o de analisar a genômica dos tumores refratários clínicos em relação aos tumores sem tratamento prévio ou sensível a para identificar enriquecimentos / depleções em lesões genéticas que podem ser passíveis de ddescoberta tapete. Apesar de sua promessa, existem duas principais passivos dessa abordagem que dificultam a descoberta rápida. Em primeiro lugar, ganhando acesso oportuno a material de tumor para interrogatório genômica pode servir como um obstáculo significativo na mudança de terapia para curar. Em segundo lugar, desconvolução da miríade de lesões genéticas na configuração resistente pode ser um desafio uma vez que os tumores podem apresentar heterogeneidade intratumoral significativa 6,7. À luz destes desafios, tem havido um aumento da confiança na descoberta pré-clínica de mecanismos de resistência. Esta abordagem pode permitir a identificação de mecanismos de resistência proeminentes antes dos ensaios clínicos 1 que podem nortear estratégias alternativas de gestão clínica naqueles pacientes que carregam esses mecanismos, quer antes ou após o início da terapia de resistência. Uma dessas ferramentas descoberta pré-clínica que está sendo amplamente utilizado é aplicar imparciais telas de RNAi funcionais. Para o exameple, Whittaker e colegas aplicaram uma tela de RNAi genoma escala para identificar que a perda de NF1 medeia a resistência aos inibidores da RAF e MEK através MAPK sustentada ativação da via 8. Estes resultados foram encontrados como sendo clinicamente relevante, como a perda de função mutações em NF1 foram observados em células tumorais BRAF -mutant que são intrinsecamente resistentes à inibição da RAF e em tumores de melanoma resistentes à activação Vemurafenibe 8. No entanto, apesar do sucesso desta abordagem, muitos alvos clinicamente relevantes são frequentemente não identificada, presumivelmente devido à polarização por perda de função desta abordagem. Em contraste, uma ferramenta para a descoberta de menos parcial pré-clínico de mecanismos de resistência envolve a geração de linhas celulares resistentes após exposição prolongada ao composto de interesse juntamente com perfis genómico ou transcriptómica baseado no NGS. Esta abordagem tem sido implementada com sucesso por vários grupos para identificar espontâneavariantes de nucleótidos únicos ou recorrentes alterações de expressão que permitem a resistência 5,9,10. Por exemplo, uma mutação F876L recorrente em AR foi recentemente descoberto em clones resistentes in vitro 3-5 e em tumores de xenoenxerto in vivo 5 antes da identificação desta mutação na clínica 4. Muito recentemente, Bangue e colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer em dois modelos clinicamente relevantes para mostrar que a maioria dos clones resistentes que surgem durante a exposição prolongada do fármaco fizessem parte de uma sub-população pré-existente que sugere que a maior parte funcionalmente relevantes mutações já são susceptíveis pré-existente que se tornam selecionado para durante a seleção de 11. Em contraste com o perfil genômico de tumores discutido anteriormente, esta abordagem benefícios de menor heterogeneidade como clones resistentes &quot;homogéneos&quot; são usados ​​para facilitar a análise de dissecção genética mais precisa do potencial de condutores. Furthermminério, excitante, para além do potencial de revelar os mecanismos de resistência, este método pode também ser aplicado para identificar os mecanismos celulares de acção e alvos de pequenas moléculas bioactivas para o qual essa informação é desconhecido 10. Dadas as vantagens claras e os múltiplos usos desta abordagem, aqui apresentamos um protocolo detalhando a implementação bem sucedida de uma tela de tais pré-clínico para maximizar o potencial para descobertas clinicamente significativas.

<table><tbody><tr><td>48-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86&amp;nbsp;</td><td>Expanding clones</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-588</td><td>Generating GI&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; curves</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Viability testing</td></tr><tr><td>Cloning discs (3 mm)</td><td>Sigma</td><td>Z374431</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>Sterile forceps</td><td>Unomedical</td><td>DF8088S</td><td>Picking clones</td></tr><tr><td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Isolating RNA</td></tr><tr><td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>Isolating gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel realigner</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Paired variant calling tool</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Variant annotation tool</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Functional impact prediction tool</td></tr></tbody></table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Para maximizar o potencial para a descoberta de controladores funcionais chave de resistência, selecionar clones de células únicas de expansão, o teste fenotípico e seqüenciamento. Como ilustrado na Figura 4A, as células HCT116 tratados durante um período prolongado com o composto citotóxico # 1 levou ao surgimento espontâneo de clones resistentes que continuaram a crescer durante o tratamento (círculos pretos tracejadas). Estes clones foram colhidos usando uma abordagem # destacadas na Figura 3 e, posteriormente, expandidos para análise fenotípica. Como mostrado na Figura 4B, os clones resistentes a todos os 1-3 apresentaram uma resistência significativa ao composto n ° 1 e a sua estreita composto análogo # 2 (maior viabilidade / crescimento), ao passo que todos os clones mostrou sensibilidade a um composto citotóxico VELCADE não relacionado. Após a confirmação da resistência fenotípica, gDNA foi isolado e submetido à análise de sequenciação de todo-exome. Ferramentas de bioinformática foram aplicadas para reduzir em no dessas variantes estruturais quesão: 1) recorrente e 2) têm o potencial de impacto funcional (Figura 5A). Variantes estruturais que conheci estes dois critérios foram confirmados por uma ferramenta de seqüenciamento independente. Tal como ilustrado na Figura 5B, uma mutação sem sentido heterozigótica que foi identificado utilizando-exome toda a sequenciação foi confirmada utilizando o método de sequenciação de Sanger (painel superior, sequência WT; painel inferior, sequência mutante). Após confirmação da sequência, a linha celular parental originalmente utilizado para o ensaio de resistência foi geneticamente manipulada para expressar o ADNc mutante para confirmar funcionalmente o papel da mutação. Tal como ilustrado na Figura 6, enquanto que a sobre-expressão de cDNA falhou o WT para conferir resistência, a expressão do ADNc mutante conferida significativamente a resistência fenotípica forçado para o composto # 1, confirmando o papel funcional desta variação estrutural, como um condutor de resistência. Todos os reagentes utilizados para esta experiência são apresentadas na Tabela 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figura 1. Disposição de placas de ensaio e de controlo. Sombra azul, poços de tratamento de compostos. Sombra branca, único meio. Os compostos são diluídos em série 1: 4 e são administradas em triplicado (BD) ou, por exemplo. 2 compostos podem ser aplicados por placa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figura 2. Curvas de viabilidade representativos. Linha ponteada representa Vermelho do eixo x dia 0 leitura. Indica o aumento das doses do composto para a direita e o eixo dos y representa a viabilidade relativa aos poços de controlo de DMSO. GI = 100 dose utilizada para atingir 100% de inibição de crescimento; IG 50 = dose utilizada para reduzir a viabilidade de 50% de controlo de DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Duas abordagens para escolher clones resistentes para a expansão. Aproxime-se 1- uso pipeta de pegar e transferir clones bem definidas para placas de 48 poços. Abordagem 2- uso de tripsina-embebido discos de clonagem para levantar clones e transferidos para placas de 48 poços. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figura 4. Confirmação da resistência obtida em relação aos clones HCT116 para o composto # 1 in vitro. (A) o composto # 1 HCT116 clones resistentes surgiu na sequência contínua selecção de três semanas. (B) A viabilidade dos clones de controlo e resistentes foi testada após 72 horas de tratamento com vários compostos. Composto # 2 é um análogo próximo do composto # 1. Velcade foi utilizado como um agente de controlo citotóxico. Os dados são apresentados como média + desvio padrão de três réplicas biológicas. Figura 5. Identificação de uma mutação única ou recorrente (variantes de um único nucleótido, SNVS) no gene A em composto # 1 HCT116 clones resistentes. Fluxo (A) de trabalho para identificar SNVS presente em todos os clones resistentes e previsto para ter um impacto funcional alta por MutationAssessor. (B) A confirmação da mutação no gene A por Sanger Sequencing. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figura 6. Re-expressão do gene mutado Uma resistência conferida ao composto # 1 in vitro. Viabilidade das linhas celulares HCT-116 modificadas foi testada após 72 horas de tratamento com o composto # 1. Linhas celulares mutantes HCT116-WT ou são estavelmente expressando cDNAs WT ou mutantes de gene A, respectivamente. Os dados são apresentados como média + desvio padrão OF três réplicas biológicas. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> pele </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> mama </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> P.? </td><td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> P.? </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr></tbody></table> Tabela 1. MSH2 Linhas Celulares -mutated. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> P.? </td&gt; <td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> estômago </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> P.? </td><td colspan="2"> pele </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> REH </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygous </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Linhas Celulares -mutated MLH1. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados.

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Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.5K visualizações.  H3 Biomedicine.  A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos. 

Vídeo: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Pesquisa do câncer

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to overcome this challenge. Here, a 2-step dose-escalation method for establishing dual-resistance to an epidermal growth factor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib, and a MET-TKI, PHA665752, is described. This method is based on simple stepwise dose-escalation of inhibitors for inducing acquired resistance in cell lines. The alternate method for generating resistant sublines involves exposing the cells to high concentrations of the inhibitor in one step. The stepwise dose-escalation method has a higher possibility of successfully inducing acquired resistance than this method. Activating EGFR mutations are biomarkers of a response to treatment with EGFR-TKI, which is an applied first-line treatment for non-small cell lung cancers (NSCLC) that harbor these mutations. However, despite reports of effective responses, the use of EGFR-TKI is limited because tumors inevitably acquire resistance. The major mechanisms behind EGFR-TKI resistance include a secondary mutation at the gatekeeper site, T790M in exon 20 of EGFR, and a bypass signal of MET. Thus, a potential solution for this issue would be a combination of EGFR-TKI and MET-TKI. This combined treatment has been shown to be effective in an in vitro study model. Acquired gefitinib-resistance was established through MET-amplification by stepwise dose-escalation of gefitinib for 12 months, and a cell line named PC-9MET1000 was generated in a previous study. To further investigate the mechanisms of acquired MET-TKI and EGFR-TKI resistance, a MET-TKI, PHA665752, was administered to these cells with stepwise dose-escalation in the presence of gefitinib for 12 months. This protocol has also been successfully applied for a number of combination therapies to establish acquired resistance to other inhibitor molecules.

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

An in vitro method for establishing dual resistance to an EGFR-TKI and a MET-TKI in cancer cells is described. This method is useful for developing treatments for patients with EGFR-mutations, who exhibit disease progression despite EGFR-TKI treatment with MET-amplification. It can also be modified for inhibitors targeting other molecules.

Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocolos para Robust Teste de resistência a herbicidas em diferentes espécies de plantas daninhas

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Ambiente

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genética

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable preclinical models that can accurately predict patient responses. One of the disadvantages of existing preclinical models is the inability to contextually preserve the human tumor microenvironment (TME) and accurately represent intratumoral heterogeneity, thus limiting the clinical translation of data. By contrast, by representing the culture of live fragments of human tumors, the patient-derived explant (PDE) platform allows drug responses to be examined in a three-dimensional (3D) context that mirrors the pathological and architectural features of the original tumors as closely as possible. Previous reports with PDEs have documented the ability of the platform to distinguish chemosensitive from chemoresistant tumors, and it has been shown that this segregation is predictive of patient responses to the same chemotherapies. Simultaneously, PDEs allow the opportunity to interrogate molecular, genetic, and histological features of tumors that predict drug responses, thereby identifying biomarkers for patient stratification as well as novel interventional approaches to sensitize resistant tumors. This paper reports PDE methodology in detail, from collection of patient samples through to endpoint analysis. It provides a detailed description of explant derivation and culture methods, highlighting bespoke conditions for particular tumors, where appropriate. For endpoint analysis, there is a focus on multiplexed immunofluorescence and multispectral imaging for the spatial profiling of key biomarkers within both tumoral and stromal regions. By combining these methods, it is possible to generate quantitative and qualitative drug response data that can be related to various clinicopathological parameters and thus potentially be used for biomarker identification.

This paper describes methods for the generation, drug treatment, and analysis of patient-derived explants for assessing tumor drug responses in a live, patient-relevant, preclinical model system.

Explantas tumorais derivadas do paciente como uma plataforma pré-clínico "viva" para prever a resistência a medicamentos em pacientes

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve survival in patients with acute myeloid leukemia (AML). A small fraction of leukemic cells that survive chemotherapy have a poised epigenetic state to tolerate chemotherapeutic insult. Further exposure to chemotherapy allows these drug persister cells to attain a fixed epigenetic state, which leads to altered gene expression, resulting in the proliferation of these drug-resistant populations and eventually relapse or refractory disease. Therefore, identifying epigenetic modulations that necessitate the survival of drug-resistant leukemic cells is critical. We detail a protocol to identify epigenetic modulators that mediate resistance to the nucleoside analog cytarabine (AraC) using pooled shRNA library screening in an acquired cytarabine-resistant AML cell line. The library consists of 5,485 shRNA constructs targeting 407 human epigenetic factors, which allows high-throughput epigenetic factor screening.

High-throughput RNA interference (RNAi) screening using a pool of lentiviral shRNAs can be a tool to detect therapeutically relevant synthetic lethal targets in malignancies. We provide a pooled shRNA screening approach to investigate the epigenetic effectors in acute myeloid leukemia (AML).

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Medicina

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

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